荧光原位杂交(课件)

1、荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.荧光原位杂交FISH的原理FISH的操作及应用FISH的展望FISH的原理FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子

2、在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。荧光原位杂交原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误 差等。与之比FISH的优点操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年方法敏感,

3、能迅速得到结果在同一标本上,可同时检测几种不同探针.不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。荧光原位杂交FISH技术包括下列几个步骤：1）探针的制备和标记 2）探针及标本变性3）杂交4）洗脱5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）6）封片7）荧光显微镜观察FISH结果荧光原位杂交探针的制备和标记 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250650个核苷酸杂交效果最好探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方

4、法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。荧光原位杂交单拷贝探针：（1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细

5、胞染色体数目异常诊断。荧光原位杂交单拷贝探针DNA片段的染色体定位荧光原位杂交单拷贝探针FISH检测微小缺失荧光原位杂交单拷贝探针FISH检测微小缺失荧光原位杂交染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)荧光原位杂交简单重复序列探针简单重复序列探针(simple repetitive probes)异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)其靶序列为卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别

6、 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断荧光原位杂交简单重复序列探针荧光原位杂交染色体的着丝粒异染色质区域简单重复序列探针间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。荧光原位杂交染色体涂染探针染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针探针来源：（1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体细胞杂种组织融合

7、的产物；（2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆/PCR扩增；（3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；应用（1）染色体数目和结构异常分析； （2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。荧光原位杂交染色体涂染探针人类染色体结构分析荧光原位杂交染色体涂染探针：染色体结构异常分析荧光原位杂交多色复合染色体FISH探针多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex FISH, M-FISH probes) 两种以上

8、不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。荧光原位杂交多色复合染色体FISH探针荧光原位杂交探针及标本的变性1）探针变性将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，510min，使双链DNA探针变性。2）标本变性将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片23h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。取出玻片标本，将其浸在7075oC的体积分数70甲酰胺/2SSC的变性液中变性23min。立即按顺序将标本经体积分数70、体积分数90和体积分数100冰乙醇系列脱水，每次5min

9、，然后空气干燥。荧光原位杂交杂交 将已变性或预退火的DNA探针10L 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上1818盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37oC杂交过夜（约1517h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。荧光原位杂交洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。（1） 杂交次日，将标本从37oC温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。（2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热4250oC的体积分数50甲酰胺/2SSC中洗涤3次，每次5min。（3） 在已预热4250oC的1SSC中洗涤3次，每次5min。（4）

10、 在室温下，将玻片标本于2SSC中轻洗一下。（5） 取出玻片，自然干燥。（6） 取200L复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。荧光原位杂交（1） 在玻片的杂交部位加150L封闭液I，用保鲜膜覆盖，37oC温育20min。（2） 去掉保鲜膜，再加150L avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖， 37oC继续温育40min。（3） 取出标本，将其放入已预热4250oC的洗脱液中洗涤3次，每次5min。（4） 在玻片标本的杂交部位加150L封闭液II，覆盖保鲜膜，37oC温育20min。（5） 去掉保鲜膜，加150L antiavi

11、din于标本上，覆盖新的保鲜膜，37oC温育40min。（6） 取出标本，将其放入已预热4250oC的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。（7） 重复步骤(1)、（2）、（3），再于2SSC中室温清洗一下。（8） 取出玻片，自然干燥。（9） 取200L PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）荧光原位杂交可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20-70oC的冰箱中的暗盒中保持数月之久。 封片荧光原位杂交先在可

12、见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源。FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。荧光显微镜观察FISH结果荧光原位杂交所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择荧光原位杂交FISH技术的应用FISH技术的应用1）基因（或DNA片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）；4）肿瘤遗传学研究荧光原位杂交FISH的展望 荧光原位杂交技术已越来越广泛的应用在细胞遗传学、 育种学、医学等多个领域,尤其在检测遗传物质的突变和染色 体上基因定位等方面显示了极大的优势。随着分子生物学的发展, 新探针的不断出现特别是全探针及染色体原位抑制杂交技术的出现,计 算机辅助的共焦显微系统和数字成像系统的发展,FISH技术的应用会加深加 快人类在肿瘤学、产前诊断、哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域的认识。FISH的展望 FISH技术和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）结合，可以更精确地描