结核分枝杆菌实验活动风险评估报告

1、单位名称文件编号：风险评估报告标题：结核分枝杆菌风险评估报告0单位名称文件编号：风险评估报告标题：结核分枝杆菌风险评估报告0第 1 13 页第六节 结核分枝杆菌试验活动风险评估报告一、生物因子一一般特性结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis 1882 年由德国微生物学家Koch1886Lehman 和Neuman结核菌。形态与染色结核分枝杆菌瘦长略弯曲，端极钝圆，大小约14)m(0.30.6)um状排列，有时呈V、Y、人字型排列，无鞭毛和芽孢。多数学者认为结核分枝杆菌无荚膜。结核分枝杆菌常用萋-尼氏Ziehl- Neelsen)抗酸性染色法染色，染色后结核分枝杆菌呈

2、现红物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等；或受物理因素、化学因 素，以及药物等因素的影响，而呈现特别变化；另外，还有可通过在内在电镜下观看细菌滤 膜L品可看到的革兰染色阳性颗粒的球状微粒型。生长特性和培育结核分枝杆菌为缓慢生长细菌，较一般细菌生长格外缓慢，在动物体内生殖代时约为15h2022h1520h可在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素或动物血清等的固体培育基上生长。最适PH6.4 7.0，在 35403537油酸血清白蛋白琼脂培育基和苏通液体培育基等，在良好的培育条件下，生长代时约1824h，培育 24乳白色或米黄色，不透亮；而在液体苏通培育基内呈粗糙皱纹状菌膜生长。生

3、化反响结核分枝杆菌能够产生硝酸盐复原酶，可使硝酸盐复原为亚硝酸盐；在酸性条件下， N 非结核性分枝杆菌不能产生硝酸盐复原酶，因此可用于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别。 长时的烟酸聚拢量较牛分枝杆菌及其他分枝杆菌高 后，呈现桃红色或红色沉淀反响。通过烟酸试验可以将结核分枝杆菌同其他分枝杆菌区分。4.免疫学特性抗结核免疫反响在结核分枝杆菌感染中起着根本作用，免疫系统能有效地抵抗大多数 约 90%HIV,进展为结核病的时机 就会大大增加。结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以 T 细胞为主的细胞免疫。当结核分枝杆T子，如IL-2、IL-6、INF-。这些因子与TNF-结核分枝杆菌的免疫属于感染免疫

4、，又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分 5.遗传特性4400 多万bp，包含了4000G和胞嘧啶C含量。结核分枝杆菌基因组在进化过程中形成了不同的分枝，主要有北京家 族、东非-印度分枝、中亚或德里家族、哈勒姆家族、拉丁美洲和地中海家族等，其中北京 家族有高毒力和高致病性。6.耐药性结核分枝杆菌产生耐性的机制主要是靶编码基因的突变所致。结核分枝杆菌的自然耐药 突变率为 10-1010-5 之间。当结核分枝杆菌的编码基因发生突变后，其对耐药的敏感性表型发生转变，这样的突变是随机、自发的，并和是否与药物接触无关。在一个菌群中，耐药个 药物也产生敏感性的转变。二来源结核杆菌可侵害全身各器官，但以

5、肺结核为最多见。结核病是一种古老的疾病，或许有 了人类之后，不久就有了它的存在。1965Sylvius 依据解剖了死于所谓“消耗病”或“痨病”人的尸体，觉察肺脏及其他器官有颗粒状的病变，依据其形态特征称之为“结核”。19732100核病灶。因而，结核的名称就此被应用至今。三传染性因结核病病变进展的患者痰中带有大量的结核杆菌 1mL100010000，则其痰涂片阳性率为40%50%。病人排菌量越大，其亲热接触者的感染率也 同，其毒力也不同，因而其传染性亦不同。感染的结核杆菌活力越强，数量越大，传染性也越强。感染药物敏感菌的结核病患者在未治疗时的相对传染性为100%。通常，结核病患者经一段时间治疗

6、后，结核杆菌对人的感染力量减弱，相对传染性降为25%；感染耐药菌的病人未10027.3%。(四)传播途径尤其是痰涂片阳性，未经治疗者的痰。飞沫感染为最常见的方式，安康人吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的飞沫10um 结核菌侵袭而机体免疫力缺乏时，感染后可能发病。其他感染途径，如经皮肤、消化道、泌尿生殖系统等均少见。五易感性1.宿主范围 结核分枝杆菌的宿主包括人、牛、犬、猪、猴、羊等。人、畜、禽类被结核杆菌感染后，在感染个体的机体多种组织内形成肉芽肿和干酪样钙化灶为特征的慢性传染病。2.易感人群 结核病主要是人群之间传播的传染病，发生结核杆菌传播主要取决于传染源排4%590%以上的人并不发病。3.易感

7、者的自身因素 结核杆菌进入人体，引起易感者机体的简单反响。易感者的身体和心Bacillus calmette gurin,BCG或受过感染后获得了免疫力，则能将入侵的结核杆菌杀死或严密包围，制止其集中，使病灶愈合。六埋伏期埋伏期尚不明确，可能为数天、数月、数年。七剂量效应关系传染源排出的飞沫受压力和黏度的影响而大小不一。飞沫核直径为110um 者在空气中漂移的时间长。进入人体末梢气管内越多，越简洁传播。豚鼠通过气溶胶途径接触15 个注射标准毒株H3Rv251000剂量。不同小鼠株系也有耐受和敏感性程度上的差异。八致病性结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量生殖引起的炎

8、症、菌体成分和代谢物质的毒性，以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结滴或含菌尘埃的方式被吸入，故肺结核较为多见。肺部感染 由于感染菌的毒力、数量、机体的免疫状态不同，肺结核可以有以下两类表现。原发感染：多发生于儿童。肺泡中有大量巨噬细胞，少数活的结核分枝杆菌进入肺泡即被巨噬细胞吞噬。该菌有大量脂质，可抵抗溶菌酶而连续生殖，使巨噬细胞患病破坏，释放出的大量菌在肺泡内引起炎症，称为原发灶。原发后感染：病灶亦以肺部为多见。病菌可以是外来的外源性感染或原来埋伏在病灶内内源性感染。由于机体已有特异性细胞免疫，因此，原发后感染的特

9、点是病灶多局限。一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化而痊愈。假设干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝杆菌至痰中。肺外感染 局部患者体内的结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、肾结核，痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。结核分枝杆菌缺乏明确的外毒素、侵袭性酶和内毒素。其毒力与素状因子、硫脂、脂阿关。 205%102030403010%。我国无准确统计数字可依据。在发病者中近半数在感染后半年至两年内于机体抵抗力低时发病90%的结核菌感染者可保持终生不发病。九变异性结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗

10、BC就是 CalmetteGuerin21908将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培育基中13230用而产生，耐药利福平药物结核分枝杆菌多联系ropB 基因突变，而异烟肼、吡嗪酰胺多联系 katG 和inhA、pncA度等国家就间续报道了全耐药结核分枝杆菌TDR-TB。十稳定性在自然环境中的稳定性与对温度的敏感性 在自然条件下结核分枝杆菌在室内阴暗潮湿68 个月；在随尘土飞扬的空气中可保持传810d；在污染的图书上可存活33168环境下可存活45 年。另有资料说明，室内的结核分枝杆菌微滴核约60%71%，3h，48%56%中6h,28%329h化学灭活 70%75530min菌，通常乙醇

11、不用于痰标本的消毒，1%甲醛处理结核分枝杆菌 5min，可使细菌死亡。5%甲12h60%80%810g/m312h分枝杆菌。对结核分枝杆菌污染的室内空气，可用甲醛气体熏蒸的方法进展终末消毒。物理灭活 1803h对湿热敏感，65 30min95 1min1005min杀死痰中结核分枝杆菌。65巴氏消毒法可用于牛奶中结核分枝杆菌的灭活。用600W 微波灭4min121压力蒸汽 30min，1323min2h 以上可杀死结核分枝杆菌，紫外线对结核分枝杆菌有肯定杀灭100w/cm230w50%70%的条件下，照耀40min99.9%以上。十一预防和治疗免疫 免疫，如体表屏障、呼吸道的纤毛上皮、肺泡巨噬

12、细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、巨噬细 对该病原体的抵抗力，是特异性免疫。细胞免疫起打算性作用，体液免疫无重要影响。目前 0%80%不等，尤其是对HIV预防 结核病的人进展抗结核药物治疗，其目的是为了尽可能杀死体内感染的结核菌，削减菌量， 烟肼，每周服药2316必需有专业医生指导，排解活动性结核病的存在，服药要进展治理，防止不良反响发生，在 知情同意根底上进展。诊断 结核病的诊断分为临床诊断和试验室诊断(1)临床诊断肺结核病的诊断参照肺结核诊断标准ws288-2022；肺外结核的诊断依据临床病症和试验室结果进展推断。2试验室诊断细菌学检测 细菌学检测包括涂片显微镜检查、分别培育和药敏试验。标本的

13、选择依据感染部位，可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。 诊断结核病。该检查简便易行，准确性较高，从痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病，但敏感性低050%。分别培育是指对猎取的标本经碱性处理后接种于培育基上，观看生长状况，诊断结核病。分别培育的结果可信度高，一般23 周内肉眼可见菌落，但个别菌需68 周，检测时间长使得应用受到限制。药敏试验是指对分别后的结核分枝杆菌在耐药培育基进展培育，以获得结核分支杆菌对抗结核药物的敏感状况。药敏试验是诊断耐药结核病的主要方法，但传统药敏试验需要4 周，影响了耐药结核病的准时诊断。免疫学检测 结核菌素试

14、验是应用结核菌素进展皮肤来测定机体对结核分枝杆菌是 种感染。细胞免疫介导的结核菌干扰素释放试验 T-cell interferon gamma release assays，TIGRAIFMGRAGRA是近年来承受酶联免疫吸附测定ELISA或酶联免疫斑点ELISPOT法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN- 核分枝杆菌的抗体，可以使用ELISA、胶体金等方法，但特异性和敏感性都不高，仅可作为结核病关心诊工具。分子检测 通过检测结核分枝杆菌或耐药结核分枝杆菌特异的基因片段从而推断结核病，有荧光定量PCR、恒温扩增等方法。该类方法检测周期短，能准时供给检测结果，但需

15、要进展进一步的应用评价。3. 治疗 结核分枝杆菌是能侵袭机体任何组织、器官引起进展性疾病的致病菌。人型结核 强增殖引起炎症反响，以及诱导机体产生迟发性变态反响性损伤有关。结核分枝杆菌可 通过呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜进入机体，侵害多种组织器官，引起相应器官的 结核病，其中以肺结核最常见。临床上肺结核大致可分为四种类型：原发性肺结核、粟 粒性肺结核、浸润性肺结核和空洞性肺结核。结核分枝杆菌对一般抗生素不敏感。对链 WHO 推举的DOTS 觉察治疗和治理策略。依据标准的DOT 规定，准时就诊、准时确诊、标准治疗和治理， 18 24100家庭以及社会均造成巨大的经济压力。耐药结核病的临床表现与一

16、般结核病无明显差 别，临床病症多种多样，轻重不等，与患者的年龄、机体的免疫状态、养分状态、并存 疾病，入侵的结核分枝杆菌的毒力、菌量及病变部位及严峻程度等均有关系。临床可表 现发热、不同程度的咳嗽、咳痰，局部患者可有咯血，病变广泛时可有呼吸困难等。肺 上的专业或定点结核病医疗机构进展诊治，通过标准化治疗方案、个体治疗方案和阅历 治疗方案的结合，以及特别治疗措施的实施能到达较好的治疗效果。二事故分析试验室本身事故 BSL-2BSL-3有关试验室已发生的事故 迄今为止未见有关证明是由于在试验室操作结核杆菌而感染人的报道。二、风险评估与风险把握一试验活动试验活动的分险评估 全部试验活动依据中华人民共

17、和国传染病防治法 病原微生手册。试验操作过程1菌株的传代操作过程在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中是用无菌吸管吸取无菌生理盐水后。加几滴到磨菌管中。翻开菌株培育管，用灭菌的接种环轻轻刮取菌落，置于磨菌管中。使用磨菌棒将菌落制成均匀的菌液。10min0.1ml传代后的培育基放置361 次观看菌落生长状况23风险因素8-20。8-20菌株的传代过程中可能消灭的风险及把握措施序号实操作验险生概率险1开盖体溅出较低整个活动中动作轻柔，勿猛烈操作，以防止液体溅出低风险2刮取中整个活动中动作轻柔，勿猛烈操作，以防止菌落溅出低风险菌落出3磨菌裂开较低整个活动中动作轻柔，以防止磨菌管裂开低分险4接种溶胶

18、较低吸管动作轻柔低分险3菌悬液制备操作过程10%吐温80 无菌生理盐水后，加几滴到磨菌管中。用一次性接种棒环23 周德颖菌落，置于磨菌管中。留意尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避开挑取 1、2 个单独菌落进展试验，刮取菌的量以半环或一环510mg为宜。使用磨菌棒将菌落制成均匀度菌液。11mg/mL 的菌液。风险因素8-21。8-21 菌悬液制备过程中可能消灭的风险及把握措施序号试验操作可险能风生概率风险把握措施残留风险1开盖启开液较低动作轻柔，勿猛烈操作，以防止液体溅出低风险体溅出2刮取菌落出中动作轻柔，勿猛烈操作，以防止菌落溅出低风险3磨菌裂开较低动作轻柔，防止磨菌管裂开低分险4菌液稀释和接种

19、操作过程菌液稀释：在无菌、带有螺旋盖的试管中以无菌吸管参加2ml 灭菌生理盐水备用，每株222SWG21mg/mL2ml 灭菌生理盐水中，即稀释 10-2mg/mL10010-4mg/mL接种：22 SWG10.01mL10-2mg/mL10-4mg/mL能均匀分散于培育基斜面；最终接种菌量为10-4mg10-6mg。风险因素8-22。序号实 验 可能风险序号实 验 可能风险操作风险发生概率风险把握措施残留风险1稀释2接种吸管吹动产生气溶胶液体溅出中吸管操作轻柔，勿猛烈操作，以防止气溶胶 低风险的产生较高以防止液体溅出4 培育操作过程接种后的培育基置于恒温培育内，直立放置361培育。4风险因素

20、8-23。8-23 菌悬液培育过程中可能消灭的风险及把握措施序号试验操作可能风险风险发生 风险把握措施概率残留风险1移送培育管培育管滑落 低移送培育管时动作裂开慎重低风险二设施设备 对于生物安全柜和压力蒸汽灭菌器，每年有专人维护、检测；每年举办两次周期性培训，确 验活动仪器设备相关风险识别与把握见表8-24。8-24 XXXBSL-3 试验室结核分枝杆菌试验操作仪器设备风险识别与把握措施仪称器名可能风险发生可能性后果描述把握措施生物安气流特别、不大可能对试验人员操作培训，设备定期维护。使用时，观看窗不要抬得过高；全柜生物安全柜消灭正压及试验室的高度危急柜内尽量少放仪器和物品，不要堵塞后面气口处

21、的空气流 通；制止在柜内使用酒精灯；在柜内的全部工作都要在工 尽量削减操作者后面的人员走动，操作者不要频繁移动及 挥动手臂以免破坏定向气流，前面的空气栅格不要被吸管 或其他材料挡住；生物安全柜的风扇在工作开头前及操作 5min。试验开头前开启安全柜排风， 待压力稳定后再进展试验培育箱二氧化碳泄漏；电源短路；培育物产生气溶胶可能性低人员接触污染每次使用二氧化碳培育箱时，留意观看二氧化碳气表， 四周无液体存在定期更换二氧化碳培育箱的空气滤膜严格标准操作，定期检查离心机离心管发生裂开气溶胶释放可能性低人员接触污染配备离心机有安全套筒，可转移到生物安全柜内处理振荡器可能性低人员样品接必需使用塑料的器皿

22、，由于玻璃可能会裂开释放出感染性单位名称文件编号：风险评估报告标题：结核分枝杆菌风险评估报告第 版单位名称文件编号：风险评估报告标题：结核分枝杆菌风险评估报告第 版第 10 页0共 13 页胶、泄露和容器裂开触污染物质，而且可能伤及操作者。在操作完毕后，容器应在生物安全柜里才能重启动冰箱保存管泄露可能性极低人员样品接触污染操作培训，做好个人防护菌器灭人员接触高温部位，发生烫伤可能性中等人员发生烫伤操作培训，做好个人防护环接种环灭菌高度接种环灭菌定期检修灭菌器低，不能灭菌不彻底三人员安康监护和安康状况评估 BSL-3清。BSL-3人员资质和培训 我中心具有开展此项试验活动的技术和人员条件试验室已

23、经开展了多年的常规结核病检测工作WHO 组织的全球结核病耐药性监测工程。工作人员多年从事结核病试验室工作，具有扎实的理论技术和丰富的实践阅历。全部进入BSL-3安全的系统培训，并经考核确认适合现岗位工作，签署知情同意书。 操作技术培训的根底上，还需进展消防和预备状态、化学品安全、生物危急和传染预防、救 BSL-3 试验室须得到试验室负责人的批准，应具体登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入。试验人员素养可能存在的风险及把握措施见表8-25.8-25 XXXBSL-3结核分枝杆菌试验操作人员风险识别与把握明细表潜在风险因素发生可能性后果严重性把握措施试验人员技术水平技术培训缺乏或操作不娴熟导

24、致误操作中试验人员需承受相关技术培训并考核合格前方能上岗关培训及演练人员安康水平试验人员身体状况不佳或患有基础疾病严峻BSL-337者不能进入未经授未经授权人员未经授权人员进BSL-3 试验室中登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入四意外大事、事故带来的风险试验室意外大事包括感染性物质的裂开及在台面、地面和其他外表溢出。感染性物质溅 入眼睛，皮肤刺伤、误接触污染物如标识不清、消毒不彻底等缘由、皮肤刺伤是发生概N95 口罩、眼罩及防护服，带高质量双层手套，有接触污染物时应马上消毒并更换的外层手套。同时， 对工作台面及发生溅洒的外表准时进展牢靠的消毒灭菌。五其他风险把握其他风险把握包括对化学、

25、物理、辐射、电器、水灾、火灾、自然灾难等的风险进展评估。工作人员试验活动的非生物风险化学、物理、辐射、电气电气设备安全风险。以下状况存在安全风险。电气设备的设计及制造不符合相关安全标准的要求。需要备用电源的设备未连接备用电源。如有资质的电工或生物医学工程师 完成电气安全测试和设备符合安全使用要求之前使用。电气设备使用人员未承受正确操作培训，操作方式不正确，降低电气安全性。电气设备使用人员未定期检查设备的可能引起电气故障的破损。非专业人员从事电气设备和电路工作。未经授权开展需要授权的工作。未实行措施对设备去污染以削减维护人员受化学或生物性污染的风险。对全部电器设备未定期进展检查和测试，包括接地系

26、统。生电流超负荷从而避开火灾。漏电保护器用于保护人员而避开触电。试验室的全部电器未接地，未承受三相插头。试验室的全部电器设备和线路不符合国家电气安全标准和标准。化学风险。 以下状况存在安全风险可能通过以下方式暴露于危急性化学品：吸入，接触，食入，针刺，通过破损皮肤。化学品的毒性作用在操作某些化学品或吸入它们的蒸汽时会对人体安康产生不良影响 液、肺、肝脏、肾脏和胃肠道系统，以及其他器官和组织造成不良影响或严峻损害，而有些化学品具有致癌性或致畸性。似的病症，并使消灭事故的可能性增大。单位名称文件编号：风险评估报告标题：结核分枝杆菌风险评估报告第 版第 单位名称文件编号：风险评估报告标题：结核分枝杆菌风险评估报告第 版第 12 页0共 13 页长期反复接触很多液态有机溶剂可能造成皮肤损害，这可能是由于有机溶剂的去脂效果， 另外还可能消灭过敏和腐蚀病症。试验室未按要求保存满足日常使用量的化学品建筑物内。相容化学品未分类存放。 的猛烈爆炸。因此，叠氮化物不应当与铜或铅如污水管以及管道设施接触。乙醚老化和 一旦碰撞，会发生爆炸并引起火灾。苦味酸和苦味酸盐在加热和撞击时会发生爆炸。化学品可能溢出造成人员损害，未能准时获