PCR实验操作课件

1、多聚酶链式反应（PCR） 扩增DNA片段 一、实验目的 了解PCR的基本原理，学习PCR的基本操作技术。 二、实验原理 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， 简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板53端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行这种变性、退火和延伸反应循

2、环，可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个模板DNA分子经20次循环扩增后可达106。PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物 PCR三步曲变性 9097退火 4565延伸 72左右PCR过程(二) PCR的反应过程变性-复性-延伸多重循环(n)模板以2En扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间三、实验材料、器材及试剂 待扩增的模板DNA ；DNA热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，1.5ml离心管架，移液器，1.5ml离心管，0.2ml离心管，枪头等。 dNTPs

3、，Taq酶，引物一对，10PCR Reaction Buffer ，TdH2O PCR反应体系的五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermus aquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校读功能无菌薄壁管中顺序加入反应体系各成分: 双/三蒸水 l 10缓冲液 2.5 l 25mmol/L Mg2+ 2.5 l 4 dNTP 2.0 l 50umol/L引物12.0 l 50umol/L引物22.0 l 模板DNA 1-2 lTaq DNA多聚酶1.0 l 25.0 l轻弹管壁，使各成分充分混匀！ 实验操作（1）PCR反应体系：四、实验

4、步骤 实验操作（2）设定循环程序:阶一: 943m 阶二: (9430s- 55 1m- 721m ) 2535循环阶三: 72510mPCR反应在带热盖的PCR仪上进行,大约需要两个半小时.操作提示1、一切器具均经高压灭菌-烘干-冷却后使用；2、各试剂小份分装，-20 保存，现用现取；3、酶的取用不离开冰浴；取液吸头、离心管均一次性使用，及时更换；电泳结果有无目标条带出现，可判别+/-结果；根据条带宽度和亮度，可直观判断扩增产量；关于PCR假阴性、假阳性及非特异扩增问题。电泳检验PCR结果、分析与评价PCR扩增NGF基因（大鼠）rat beta-nerve growth factor seq

5、uence5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc541 accccgcgtg c

6、tgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc -3Perim 1: (5) gat cgg cgt aca ggc aga ac (3) 328-347Perim 2: (3) cgc ggg gtg aac gga gtc tc (5) 529-548 预期扩增长度：220bp关于PCR假阴性、假阳性问题每组PCR都要设立阴性对照（加无关DNA，而不是不加DNA），以检测有无污染；每组PCR都要设立阳性对照（加肯定的DNA或前次PCR产物），以检测PCR的效率；对假阴性问题，可通过重复实验排除错误、改善反应条件（用梯度实验选择复性

7、温度）等排查、排除之；假阳性多数都是模板DNA污染的问题，查实后必须更换所有试剂；关于PCR非特异性扩增问题：引物特异性引物纯度两条引物的Tm值模板纯度模板二级结构退火温度（时间）反应体系中引物、dNTP、Mg+、模板、Taq酶浓度。实验延伸检索了解PCR的进展：逆转录PCR；巢式PCR；反向PCR；差示PCR；单链构象多态性PCR；实时定量PCR； 逆转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligo dT, 逆转录酶特异性引物, Taq酶用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段位置5、mRNA丰度巢式PCR采

8、用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内P1上P1下P2上P2下用途：验证第一次PCR产物的特异性 进行特殊PCR，如合成探针模板反向PCR已知序列PCR用途：未知序列的研究DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。单链构象多态性PCR (SSCP-PCR) PCR引物设计一对引物，分别与靶DNA5和3端互补长度：1530个核苷酸引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性引物的设计可以参照： 两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer p

9、remier5.0/oligo软件 核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/ PCR技术讨论版使用blast程序，输入引物序列，等待结果报告。GenBank网址：/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi /primo/ 引物设计网址：PCR的反应特点特异性强灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10- 12级的起始待测模板扩增到微克(g= 10 -6)水平简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应 对标本的纯度要求低： DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测五、注意事项 使用的全部溶液都应该没有核

10、酸和核酸酶的污染. 所有PCR试剂中使用的水都应该是最高质量的三蒸水. 所有试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后再分装成仅够一次使用的量储存,从而确保每次扩增实验之间的一致性. 普通高中课程 标准实验教科书 生物 选修 1生物技术实践专题4 DNA与蛋白质技术课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段课程标准具体内容标准尝试PCR（ DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作和应用 。 活动建议用某一DNA片段进行PCR扩增。课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段教材内容:基础知识 (一) PCR原理 (二) PCR的反应过程实验操作操作提示结果分析与评价课题延伸练习一、课题目标本课题通过尝试PC

11、R（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用 教材分析二、课题重点与难点课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。课题难点：PCR的原理。教材分析三、课题背景分析课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。教师在导入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。教材分析

12、四、基础知识分析与教学建议（一）PCR原理知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成 成分与反应条件；2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。教材分析（一）PCR原理 教学建议： 理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修2遗传与进化中的有关DNA复制的知识。在此基础上，学生需要进一步了解DNA双链的方向，能够区分DNA的3端和5端。此外，学生还需要了解DNA聚合酶的特性，如只能从DNA的3端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA等。教学建议（一）PCR原理 教学建议：Taq DNA聚合酶的应用，解决了

13、高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化，是一个重要的知识点。教师可以结合专题2中课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq细菌的发现过程，帮助学生加深理解。教学建议（二）PCR的反应过程知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。教材分析（二）PCR的反应过程 教学建议：这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图5-9“PCR反应过程图解”详细地描绘了参与PCR的各组成成分；每一轮反应的三个基本步骤变性、复性和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每个步骤所具有的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地

14、方时，教师要及时给予解答。教学建议(一) PCR原理体内DNA复制:模板DNA原料: dNTP酶: 解旋酶、DNA pol. 起始引物、合成方向合成环境解链模板变性引物-起始引物-模板复性子链延伸子链延伸(一) PCR原理Hot water bacteria: Thermus aquaticusTaq DNA polymeraseLife at High Temperaturesby Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone 1994 Yellowstone Association for Natural Science/Bact303/b27加样

15、器的使用结果分析与评价此为紫外光吸收检测的结果检验法，实践中很少用；普遍采用琼脂糖凝胶电泳法检验PCR结果网站链接北大生物信息中心/生物通/生物谷/中华基因网/中国生物论坛/生物引擎/more.html基因中国 / PCR应用相关文章及链接：PCR技术的应用/experiment/pcr8/183866.shtml /show/download/shtml/001373.shtml /Article/resource/ebook/200603/8232.shtml PCR促进新药研发/content.aspx?id=3070 火眼金睛PCR 技术/news.php?id=577 DNA出庭作证

16、/news.php?id=2006 Animation of molecular biotech Biology Animation Library /ddnalc/resources/dnaarray.html Molecular Genetic Methods - Lecture TopicsChapterPolymerase Chain Reaction (PCR)7DNA sequencing (manual/automated)7DNA Fingerprinting (DNA typing/profiling)8Single nucleotide polymorphisms (SNP

17、s)9Practical applications of PCR, Sequencing, Fingerprinting, & SNPs:Amplify DNA for Cloning (PCR)Amplify DNA for sequencing without cloning (PCR)DNA sequencing reaction (PCR)Mapping genes and regulatory sequencesLinkage analysis (identify genes for traits/diseases)Diagnose diseasePathogen screening

18、Sex determinationForensic analysisPaternity/maternity (relatedness)Behavioral ecology studies (relatedness)Molecular systematics and evolution (comparing homologous sequences in different organisms)Population genetics (theoretical and applied)Physiological genetics (studying basis of adaptation)Live

19、stock pedigrees (optimize breeding)Wildlife management (stock identification/assessment)Detection of Genetically Modified Food (GMOs)Background on the Polymerase Chain Reaction (PCR)Ability to generate identical high copy number DNAs made possible in the 1970s by recombinant DNA technology (i.e., cl

20、oning).Cloning DNA is time consuming and expensive ($15/sample). Probing libraries can be like hunting for a needle in a haystack.PCR, “discovered” in 1983 by Kary Mullis, enables the amplification (or duplication) of millions of copies of any DNA sequence with known flanking sequences. Requires onl

21、y simple, inexpensive ingredients and a couple hours.DNA templatePrimers (anneal to flanking sequences)DNA polymerasedNTPsMg2+BufferCan be performed by hand or in a machine called a thermal cycler.1993: Nobel Prize for ChemistryHow PCR works:Begins with DNA containing a sequence to be amplified and

22、a pair of synthetic oligonucleotide primers that flank the sequence.Next, denature the DNA to single strands at 94C.Rapidly cool the DNA (37-65C) and anneal primers to complementary s.s. sequences flanking the target DNA.Extend primers at 70-75C using a heat-resistant DNA polymerase such as Taq polymerase derived from Thermus aquaticus.Repeat the cycle of denaturing, annealing, and extension 20-45 times t