SOD的性质与固定化

1、08 级生物工程一班 刘婷婷 0806606114 超氧化物歧化酶与超氧化物歧化酶的固定化 一、超氧化物歧化酶别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代 谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD 具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是 1938 年 Marn 等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对 SOD 的研究己有七十多年的历史。 1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反 应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。（一）SOD的种类及分布从目前分离取得的

2、SOD 来看，它是一种金属酶，其金属部分是酶的辅基组成，对酶的免疫原性也起 很大的作用。根据酶的金属辅基的不同，可以大致分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。（ 1） Cu/Zn-SOD基本上所有的真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD ）。例如，市场上销售的从牛红血球中纯化的 Cu-Zn-SOD，PDB 1SXA, EC 1.15.1.1。Cu/Zn SOD是一个二聚 体，分子量为 32,500 。两个亚基主要通过疏水和静电相互作用结合在一起。铜和锌则与活性位点上 的组氨酸侧链形成配位键。（ 2）Mn-SOD几乎所有的线粒体和许多细菌（如大

3、肠杆菌）含有结合锰的超氧化物歧化酶（Mn SOD ）。例如，人类线粒体中的 Mn-SOD， PDB 1N0J, EC 1.15.1.1 。锰离子与三个组氨酸的侧链、一个天冬氨 酸的侧链和一个水分子或羟基（取决於锰的氧化态）配位结合。（ 3） Fe-SOD大肠杆菌和其他一些细菌还含有结合铁的超氧化物歧化酶 （Fe SOD ）：一些细菌只含 Fe SOD， 另一些只含Mn SOD，还有一些则两种都含有。例如，大肠杆菌中的Fe SOD : PDB 1ISA, EC 1.15.1.1。 Fe SOD 也被发现存在於植物的色素体中。 Mn SOD 和 Fe SOD 的活性位点具有同样类型的胺基酸与 金属

4、离子配位。（二）SOD的结构与性质Cu/Zn-SOD分子量在33 000左右，由两个亚基组成，每一个亚基各含一个Cu2+和Zn2+离子，紫外 吸收光谱均在250270nm范围内（只有发光杆菌的Cu/Zn-SOD例外），它们的这一共同特点与一般蛋 白的紫外吸收峰 280nm 均有偏离，其原因是该酶分子中色氨酸和酪氨酸含量少或根本没有。赤子爱胜蚓 Cu/Zn-SOD 的亚基有 156 个氨基酸残基，其中甘氨酸含量最大，占氨基酸总量的 21%。鸭血红细胞 Cu/Zn-SOD的N-端为丙氨酸，分子量为32, 359，由两个亚基组成。猪红细胞Cu/Zn-SOD经圆二色谱 表明：空间结构呈B-折迭及无规态

5、，含有极少量的a-螺旋。Mn-SOD依来源不同有着明显的差异。原核细胞来源的Mn-SOD分子量为40 000，由两个亚基组成， 各含一个Mn2+离子。真核细胞线粒体来源的Mn-SOD分子量为80 000，由各含一个Mn2+离子的四个亚 基组成，两者均呈粉红色。Fe-SOD仅存在于原核细胞中，制品分子量为38 000，呈黄色，由两个各含一个Fe2+离子的亚基组 成。棕色固氮菌Av-230中的Fe-SOD，由各含一个Fe2+离子的两个相同亚基组成，二级结构中，a-螺旋 含量约占 20%左右。总之，不同生物体内所含的SOD种类和数量差异很大，并有很强的组织专一性9。目前已弄清了 七种 SOD 的一级

6、结构。（三）SOD的应用SOD作为一种人体内最重要的酶之一，它所起的作用是不可小视的。正常生命过程中产生的超氧阴离 子自由基是维持生命所必需的，当其浓度过高时，对机体会造成损害。因此超氧化物歧化酶作为生物体内 氧自由基的天然特异清除剂，在生物体的生命活动中具有重要意义，有着广泛的医用价值，可作为药品、 食品及日化产品的添加剂。大量研究表明，SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一。SOD是超氧 化阴离子自由基 O-2 的“克星”，具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗衰老等作用。在病毒性疾病、自身免疫性 疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病、癌和癌的放射治疗预防以及 人类

7、长寿等领域的研究中也己有突破性进展。SOD被批准用于临床使用，它对一些由于年龄、疾病或伤 害造成的组织硬化以及纤维化显示出强大的再生修复能力。 SOD 已被成功的应用于放疗后的辅助治疗、 控制心脏病人的进展、用于治疗严重的风湿性关节炎，红斑狼疮等疾病。通过测定SOD酶活性及MDA 水平，可以间接了解体内自由基的代谢状况，了解患者体内自由基的活动情况，从而对患者进行相应的治 疗。在临床上可用 SOD 治疗和预防下列疾病：急性炎症和水肿、氧中毒预防（预防措施，进入高压氧舱的 工作人员，可预先注射SOD）、氧中毒治疗、自身免疫性疾病（早期治疗）、肺气肿、辐射病及辐射防护、 老年性白内障、抗衰老。同时

8、， SOD 具有的抗氧化性及独特的生理功能使其作为食品添加剂和重要的功能性基料而用于食品工 业。另外， SOD 既可以作为药用酶，也可以作为化妆品的添加剂，它最有益的应用莫过于抗衰老，国际 生化委员会，FDA称其为“抗衰因子”，具有抗衰老、防晒、抗炎等功效oSOD可能是真正令我们延长寿命 的有力发现，科学工作者将产生人类SOD的基因片段SOD1插入果蝇的运动神经细胞，SOD1使果蝇产 生了比一般水平更多的果蝇SOD，更重要的是，它们平均寿命增加了 40%。二、超氧化物歧化酶的固定化 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，分两步制备固定化超氧化物歧化酶活化壳聚糖粉的制备：取2. 0 g 壳聚糖粉末，加

9、入25 ml 0. 3%的戊二醛溶液，室温搅拌3 h后，于4C下放置过夜；次日抽滤，并用50 ml磷酸盐缓冲液洗涤，得到淡黄色活化的壳聚糖粉末。固定化酶的制备：取0. 5 g 活化的壳聚糖粉末，加入10 ml 超氧化物歧化酶液，室温下搅拌1. 5 h,于4C下放置过夜；取少量上清液保存在4C待测，将余下的混合物抽滤，并用50 ml磷酸 盐缓冲液分5次洗涤，即得到固定化SOD酶粉。壳聚糖粉（空白对照）的制备：取0. 5 g 活化的壳聚糖粉末，加入10 ml 小牛血清白蛋白液，室温下 搅拌1. 5 h,于4C下放置过夜，抽滤，用50 ml磷酸盐缓冲液分5次洗涤，即得空白对照壳聚糖粉。1、酶活力的测

10、定（1）溶液酶活力的测定：取3支带刻度的离心管，将溶液酶加入Tris-HCl缓冲液（pH & 02）中预热10 min后，加入邻苯三酚，准确反应3 min,加入终止剂5%维生素C，室温放置5 min后测定A325值。按表1加 样，以1号管溶液为空白，测定各管的a325值。表1溶液酶活力测定实验抑样量Tab 1. Samplesfor activity Lesl of SOD before im-HubilizatHm离心管Tris-HClSOD溶叛酶轴45 mmol /1邻苯三酚00去离子水5砺维生素1：编号缓冲叛fcj410I90020502901010503910100502）固定化酶活力的测定：取3支带刻度的离心管，将固定化酶及空白对照壳聚糖粉加入Tris-HCl缓冲 液（pH & 02）中预热10 min后，加入邻苯三酚，准确反应3 min，加入终止剂5%维生素C，在室温下放 置数分钟，3 200 g离心10 min，吸取上清液，测定A325值。按表2加样，以1号管溶液为空白，测定各 管的A325值。表2固定化酶活力测定实验加甘量Tah 2. Samples loaded ftw a