津岛链霉菌JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用

1、津岛链霉菌JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用作者：宋利沙蒋妮张占江陈乾平冯世鑫来源：南方农业学报2021年第08期图2菌株JTJ对三七根腐病菌滤纸条法抑制结果Fisc.2ResultsofiiilubihonellectofstrainJT-2FtoEYofavibyfilterstripmethod蠹:对照很：滤纸条眩结果A:Control:B:Filterpaperstdpmethodresults图3菌株jT-2F对三七根腐病菌菌丝的抑制作用Fig.3hiliibitoiyeffectolstrniriJ1-2FoilmyceliaofAsoJaniA:对照;也对根腐病茵的抑制效果心正常

2、苗邈;D:畤璀菌彗AtContiTcl：B:LnhibitoryeffectagainstiC：Normalinycelia:D:Abnor1umlmycelia囹-I菌株HTF产几丁质醴*纤维蛊强知蚩白酣能力测定结臬Fip.4Theabilityofsrram,.TT-27mproducer1iiriuisc,ccllubceicicIingrcnjeA：丿捽堪：日:屢甲期邢f素柄用界旱心酪盟口堀择川A：CliifiirLiudiiiijxliuiaaj3il)nxynaE-lliylcellLLlmenicdiiucLC：CRHcinmcdiiu叮a2菌株JT-2F发酵液对三七根腐病苗的防

3、治效果lablc2Control亡扯clofieimcntationliquidofstrainJ1-2FonEsolafii桶禅倍数Dilutiontimes貓斑而积心山）Diseasespotarea訪奴()Controlefleet肿：液6.280.66g78.43土0,02a109550.63ef6720002b2010.9210.40dc52.47i0.0lbc50B.070.99d55J0i0O3d1002O.13O.82bc30,830.03e2002146472.16b26290.07f对舲CK29.1li3.37a=图5茴珠JTJF不问稀畀倍数发酵裁对三七块根上病斑的抑制效果

4、Fig.5LttijbiiiuuofdLfitfientdilutiunntliusafstiiiiiLJT-2FleiiiieEiUCioiibiotkonMLiulbctedbpotiouroottubersofP.notoginsangAM朝:B:喘液;C:稲粗时言：D:輔胖20借:E:虧择50倍:F用额皿;G曲样2QQf合A:CK:B：Rawliqind；C:Diluiiou10tluies:D：DlLliIidu20Lunes;EeDlIlHion5Dtimes-1iDiluLkOJ)LOOunie：-：G：Dilution2(M)times图1菌株JTJF与三七根腐病菌平板对峙结果

5、Fig.iPlatecoiifrontaiioneffectofstrainJT-2FagainstF.A：对平板对峙结舉A；Coiitivl；B:PlakGQiifroutfitioDresult表1拮抗菌株JTJF滤纸条法的抑菌谱TableITheaiiiiinicrobLalspectrumofancagoinsticstrainJT-2!byfilterpaperstripmethod病原菌Patliopen抑菌率（舛）Inhibitionrate三七翳斑病繭M/emt87.06i0.22a三七茨瓦病菌B.enters2,221,16b-L炭疽病WC.e171.04d平腔IA滞口驴S1

6、73l9同列数据斎不同小写字冊表示莖异显舟（尸=0一衣2同Diffeientlowercasekitersinthesmilecohunnrepresentedsigni五canttJiffereuce（P0J05）.ThesamewasappliediuTable2摘要：【目的】明確津岛链霉菌JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用，为三七根腐病的生物防治提供理论依据。【方法】采用平板拮抗和滤纸条法测定津岛链霉菌(Streptomycestsukiyonensis)菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的的抑制作用，并采用离体块根刺伤接种法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌的防治效果;

7、利用酶联免疫分析(ELISA)法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等酶活性。【结果】菌株JT-2F对三七根腐病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌率达76.47%，对3种三七叶部病害病原菌也有明显的抑制效果，抑菌率均超过80.00%。菌株JT-2F的发酵液对病原菌菌丝有明显的抑制作用，使菌丝体畸形、膨大变粗，并呈串珠形状。产酶能力测定结果显示，菌株JT-2F可分泌几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶，可破坏病原菌菌丝体，并抑制病原菌生长。离体防效试验结果显示，菌株JT-2F发酵原液对离体三七块根根腐病的防效达78.43%。【结论】津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病菌有较好的抑制作用，具有较好

8、的生防开发潜力。关键词：三七;根腐病菌;津岛链霉菌;抑制作用中图分类号：S435.672文献标志码：A文章编号：2095-1191(2021)08-2133-07InhibitoryofantagonisticStreptomycestsukiyonensisJT-2FtoFusariumsolaniofPanaxnotoginseng(Burk.)F.H.ChenSONGLi-sha1，JIANGNi1*，ZHANGZhan-jiang1*，CHENQian-ping1，FENGShi-xin1(GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants，Nanning5

9、30023，China)Abstract：【Objective】TheinhibitoryeffectofStreptomycestsukiyonensisJT-2FagainstFusariumsolaniofPanaxnotoginseng(Burk.)F.H.ChenwasclarifiedtoprovidetheoreticalbasisforbiologicalcontrolofrootrotofP.notoginseng.【Method】TheinhibitioneffectofS.tsukiyonensisJT-2FonF.solaniandthreeP.notoginsengl

10、eafdiseasepathogenswasdeterminedbyplateantagonismandfilterpapermethod，andthecontroleffectofJT-2FstrainonP.notoginsengrootrotwasdeterminedbyinvitroroottuftinjuryinoculationmethod，enzyme-linkedimmunoassay(ELISA)wasusedtodeterminetheactivitiesofprotease，cellulaseandchitinaseinfermentationbroth.【Result】

11、TheresultsshowedthatJT-2FhadastrongantagonisticeffectonF.solani，anditsinhibitionratereached76.47%.ThecontroleffectofstrainJT-2FonthreeJT-2Fstrainsfermentationbrothhadobviousinhibitoryeffectonthepathogenicmycelium，whichmadethemyceliumdeformed，enlargedandthickened，andinastringofbeadsshape.JT-2Fstrainc

12、ouldsecreteprotease，cellulaseandchitinasetodestroythemyceliaandinhibitthegrowthofthepathogen.InvitrocontroleffecttestshowedthatJT-2Ffermentationbrothshowed78.43%controleffectofinvitroP.notoginsengrootrot.【Conclusion】S.tsukiyonensisJT-2FstraincaninhibitthegrowthofF.solaniofP.notoginseng，andhaspotenti

13、alinbio-controldevelopment.Keywords：Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen;Fusariumsolani;Streptomycestsukiyonensis;inhibitingeffectFoundationitem：GuangxiNaturalScienceFoundationJointFundingCultivationProject(2019GXNSFAA245040);TheFundforLocalScienceandTechnologyDevelopmentGuidedbytheChineseGovernment(Guik

14、eZY20198010);YouthScienceFundationofGuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants(Guiyaoji201801);GuangxiBotanicalGardenScienceandTechnologyInnovationTeamProject(2019007)0引言【研究意义】三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材，主要分布于广西和云南等地，具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效(国家药典委员会，2020)。目前，根腐病是三七種植面临的重要问题，主要集

15、中在由镰孢属真菌(Fusariumspp.)引起的根腐病(董鲜等，2018;张晋豪等，2020)，其发病原因复杂，防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主，但长期使用化学农药易使病菌产生抗、耐药性(丁中等，2001;张明亮等，2019)，使防治效果下降，甚至对环境造成污染，产生的农药残留也严重影响中药材的质量安全，危害人类健康。相比于化学防治技术，微生物防治植物病害因具有高效、安全、环保的优点，已逐渐成为植物病害防治的重要方法之一，是目前国内外研究重点，也是未来有机中药材生态种植的发展趋势。【前人研究进展】放线菌由于能产生大量结构多样的具有抗菌活性的抗生素，且存在于不同类型的土壤和水中

16、，菌种资源更丰富，因而在生物防治的应用中更为广泛和有效(LeeandHwang，2002;Jungetal.，2018)。目前，放线菌用于防治作物病害的研究已有较多报道。宗兆锋等(2002)研究发现，从番茄叶片上分离获得的放线菌对7种病原真菌(大丽轮枝菌、扩展青霉菌、胶孢炭疽病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉红聚端孢菌和梨状毛霉菌)具有不同程度的抑制效果;董美玉等(2008)研究表明，从土壤中分离到的放线菌ZY105对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率达85%;申哲等(2008)和涂璇等(2008)研究发现，淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黄瓜炭疽病菌等多种植物病原菌均有很好的

17、拮抗作用;刘琴等(2020)研究表明，使用娄彻氏链霉菌SR-1102的100倍液灌根对番茄枯萎病的防治效果达72.84%;牛红杰等(2020)从黄瓜根际土壤分离得到1株小链霉菌，该菌对黄瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌)具有一定的抑制作用;汤曼利(2020)研究表明，海洋放线菌梅久兰链霉菌F28对海洋细菌副溶血弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，并对其他8种病原菌具有广谱抑菌活性。放线菌对中药材根腐病抑制作用的研究有少量报道，强薇等(2014)研究发现，从人参根际土壤中筛选出的7株放线菌对人参根腐病的拮抗率达65.11%;杜用玺等(2020)研究表明，3株放线菌及其发酵液对丹参根

18、腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超过60%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现1株放线菌津岛链霉菌(Streptomycestsukiyonensis)JT-2F对三七根腐病菌具有很强的拮抗作用(Songetal.，2020)，但尚未就该菌对三七根腐病菌的抑制作用开展研究。【拟解决的关键问题】采用平板拮抗和滤纸条法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌的抑制作用，评价其对三七根腐病菌的抑制效果;在光学显微镜下观察菌株JT-2F对三七根腐病菌抑制作用的影响;利用酶联免疫分析(ELISA)法测定菌株JT-2F发酵液中蛋

19、白酶、纤维素酶和几丁质酶活性，以验证菌株JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用;进一步开展离体块根防效研究，从表观上证明津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病的防治作用，为三七根腐病的防控提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株供试三七叶部病害病原菌包括三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)和三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)，根部病害病原菌为三七根腐病菌(F.solani)，均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。供试津岛链霉菌JT-2F为广西药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株

20、，菌株登录号MK368447。1.1.2培养基采用高氏一号培养基培养放线菌。参考仇艳肖(2010)的方法，分别制备含几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白的培养基，以检测菌株是否具有几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性。几丁质培养基：胶体几丁质5.0g，MgSO47H2O0.5g，FeSO47H2O0.01g,KH2PO40.3g,K2HPO40.7g,ZnSO40.001g,琼脂20.0g,H2O1000mL,pH7.27.4。羧甲基纤维素钠(CMC)培养基:CMC-Na5.0g,MgSO47H2O0.1g,(NH4)2SO40.5g,K2HPO40.25g,琼脂20.0g,H2O1000mL。酪蛋白培

21、养基：取5.0g脱脂奶粉加入到50mL蒸馏水中，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水，将2种溶液分开灭菌，待冷至4550时，将2种溶液混匀倒平板,即成牛奶平板。Foundationitem：GuangxiNaturalScienceFoundationJointFundingCultivationProject(2019GXNSFAA245040);TheFundforLocalScienceandTechnologyDevelopmentGuidedbytheChineseGovernment(GuikeZY20198010);YouthScienceFundationofGuangxiBot

22、anicalGardenofMedicinalPlants(Guiyaoji201801);GuangxiBotanicalGardenScienceandTechnologyInnovationTeamProject(2019007)0引言【研究意義】三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材,主要分布于广西和云南等地,具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效(国家药典委员会,2020)。目前,根腐病是三七种植面临的重要问题,主要集中在由镰孢属真菌(Fusariumspp.)引起的根腐病(董鲜等，2018;张晋豪等，202

23、0)，其发病原因复杂,防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主,但长期使用化学农药易使病菌产生抗、耐药性(丁中等,2001;张明亮等,2019),使防治效果下降,甚至对环境造成污染,产生的农药残留也严重影响中药材的质量安全,危害人类健康。相比于化学防治技术,微生物防治植物病害因具有高效、安全、环保的优点,已逐渐成为植物病害防治的重要方法之一,是目前国内外研究重点,也是未来有机中药材生态种植的发展趋势。【前人研究进展】放线菌由于能产生大量结构多样的具有抗菌活性的抗生素，且存在于不同类型的土壤和水中，菌种资源更丰富，因而在生物防治的应用中更为广泛和有效(LeeandHwang,2002;J

24、ungetal.,2018)。目前，放线菌用于防治作物病害的研究已有较多报道。宗兆锋等(2002)研究发现，从番茄叶片上分离获得的放线菌对7种病原真菌(大丽轮枝菌、扩展青霉菌、胶孢炭疽病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉红聚端孢菌和梨状毛霉菌)具有不同程度的抑制效果;董美玉等(2008)研究表明，从土壤中分离到的放线菌ZY105对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率达85%;申哲等(2008)和涂璇等(2008)研究发现，淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黄瓜炭疽病菌等多种植物病原菌均有很好的拮抗作用;刘琴等(2020)研究表明，使用娄彻氏链霉菌SR-1102的100倍液灌根对番茄枯

25、萎病的防治效果达72.84%;牛红杰等(2020)从黄瓜根际土壤分离得到1株小链霉菌，该菌对黄瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌)具有一定的抑制作用;汤曼利(2020)研究表明，海洋放线菌梅久兰链霉菌F28对海洋细菌副溶血弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，并对其他8种病原菌具有广谱抑菌活性。放线菌对中药材根腐病抑制作用的研究有少量报道，强薇等(2014)研究发现，从人参根际土壤中筛选出的7株放线菌对人参根腐病的拮抗率达65.11%;杜用玺等(2020)研究表明，3株放线菌及其发酵液对丹参根腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超过60%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现1株放

26、线菌津岛链霉菌(Streptomycestsukiyonensis)JT-2F对三七根腐病菌具有很强的拮抗作用(Songetal.，2020)，但尚未就该菌对三七根腐病菌的抑制作用开展研究。【拟解决的关键问题】采用平板拮抗和滤纸条法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌的抑制作用，评价其对三七根腐病菌的抑制效果;在光学显微镜下观察菌株JT-2F对三七根腐病菌抑制作用的影响;利用酶联免疫分析(ELISA)法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性，以验证菌株JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用;进一步开展离体块

27、根防效研究，从表观上证明津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病的防治作用，为三七根腐病的防控提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株供试三七叶部病害病原菌包括三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)和三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)，根部病害病原菌为三七根腐病菌(F.solani)，均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。供试津岛链霉菌JT-2F为广西药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株，菌株登录号MK368447。1.1.2培养基采用高氏一号培养基培养放线菌。参考仇艳肖(20

28、10)的方法，分别制备含几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白的培养基，以检测菌株是否具有几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性。几丁质培养基：胶体几丁质5.0g，MgSO47H2O0.5g，FeSO47H2O0.01g，KH2PO40.3g，K2HPO40.7g，ZnSO40.001g，琼脂20.0g，H2O1000mL，pH7.27.4。羧甲基纤维素钠(CMC)培养基：CMC-Na5.0g,MgSO47H2O0.1g,(NH4)2SO40.5g,K2HPO40.25g,琼脂20.0g,H2O1000mL。酪蛋白培养基：取5.0g脱脂奶粉加入到50mL蒸馏水中，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水，将2种溶

29、液分开灭菌，待冷至4550时，将2种溶液混匀倒平板,即成牛奶平板。Foundationitem：GuangxiNaturalScienceFoundationJointFundingCultivationProject(2019GXNSFAA245040);TheFundforLocalScienceandTechnologyDevelopmentGuidedbytheChineseGovernment(GuikeZY20198010);YouthScienceFundationofGuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants(Guiyaoji201801);

30、GuangxiBotanicalGardenScienceandTechnologyInnovationTeamProject(2019007)0引言【研究意義】三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材,主要分布于广西和云南等地,具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效(国家药典委员会,2020)。目前,根腐病是三七种植面临的重要问题,主要集中在由镰孢属真菌(Fusariumspp.)引起的根腐病(董鲜等，2018;张晋豪等，2020)，其发病原因复杂,防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主,但长期使用化学农药易

31、使病菌产生抗、耐药性(丁中等，2001;张明亮等，2019)，使防治效果下降，甚至对环境造成污染，产生的农药残留也严重影响中药材的质量安全，危害人类健康。相比于化学防治技术，微生物防治植物病害因具有高效、安全、环保的优点，已逐渐成为植物病害防治的重要方法之一，是目前国内外研究重点，也是未来有机中药材生态种植的发展趋势。【前人研究进展】放线菌由于能产生大量结构多样的具有抗菌活性的抗生素，且存在于不同类型的土壤和水中，菌种资源更丰富，因而在生物防治的应用中更为广泛和有效(LeeandHwang，2002;Jungetal.，2018)。目前，放线菌用于防治作物病害的研究已有较多报道。宗兆锋等(20

32、02)研究发现，从番茄叶片上分离获得的放线菌对7种病原真菌(大丽轮枝菌、扩展青霉菌、胶孢炭疽病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉红聚端孢菌和梨状毛霉菌)具有不同程度的抑制效果;董美玉等(2008)研究表明，从土壤中分离到的放线菌ZY105对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率达85%;申哲等(2008)和涂璇等(2008)研究发现，淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黄瓜炭疽病菌等多种植物病原菌均有很好的拮抗作用;刘琴等(2020)研究表明，使用娄彻氏链霉菌SR-1102的100倍液灌根对番茄枯萎病的防治效果达72.84%;牛红杰等(2020)从黄瓜根际土壤分离得到1株小链霉菌，该菌对

33、黄瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌)具有一定的抑制作用;汤曼利(2020)研究表明，海洋放线菌梅久兰链霉菌F28对海洋细菌副溶血弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，并对其他8种病原菌具有广谱抑菌活性。放线菌对中药材根腐病抑制作用的研究有少量报道，强薇等(2014)研究发现，从人参根际土壤中筛选出的7株放线菌对人参根腐病的拮抗率达65.11%;杜用玺等(2020)研究表明，3株放线菌及其发酵液对丹参根腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超过60%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现1株放线菌津岛链霉菌(Streptomycestsukiyonensis)JT-2F对三七根腐病菌

34、具有很强的拮抗作用(Songetal.,2020),但尚未就该菌对三七根腐病菌的抑制作用开展研究。【拟解决的关键问题】采用平板拮抗和滤纸条法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌的抑制作用,评价其对三七根腐病菌的抑制效果;在光学显微镜下观察菌株JT-2F对三七根腐病菌抑制作用的影响;利用酶联免疫分析(ELISA)法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性，以验证菌株JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用;进一步开展离体块根防效研究，从表观上证明津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病的防治作用，为三七根腐病的防控提

35、供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株供试三七叶部病害病原菌包括三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)和三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)，根部病害病原菌为三七根腐病菌(F.solani)，均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。供试津岛链霉菌JT-2F为广西药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株，菌株登录号MK368447。1.1.2培养基采用高氏一号培养基培养放线菌。参考仇艳肖(2010)的方法,分别制备含几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白的培养基,以检测菌株是否具有几丁质酶、

36、纤维素酶和蛋白酶的活性。几丁质培养基：胶体几丁质5.0g，MgSO47H2O0.5g，FeSO47H2O0.01g,KH2PO40.3g,K2HPO40.7g,ZnSO40.001g,琼脂20.0g,H2O1000mL,pH7.27.4。羧甲基纤维素钠(CMC)培养基:CMC-Na5.0g,MgSO47H2O0.1g,(NH4)2SO40.5g,K2HPO40.25g,琼脂20.0g,H2O1000mL。酪蛋白培养基：取5.0g脱脂奶粉加入到50mL蒸馏水中，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水，将2种溶液分开灭菌，待冷至4550时，将2种溶液混匀倒平板,即成牛奶平板。Foundationite

37、m：GuangxiNaturalScienceFoundationJointFundingCultivationProject(2019GXNSFAA245040);TheFundforLocalScienceandTechnologyDevelopmentGuidedbytheChineseGovernment(GuikeZY20198010);YouthScienceFundationofGuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants(Guiyaoji201801);GuangxiBotanicalGardenScienceandTechnologyInno

38、vationTeamProject(2019007)0引言【研究意义】三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材,主要分布于广西和云南等地,具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效(国家药典委员会,2020)。目前,根腐病是三七种植面临的重要问题,主要集中在由镰孢属真菌(Fusariumspp.)引起的根腐病(董鲜等，2018;张晋豪等，2020)，其发病原因复杂，防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主，但长期使用化学农药易使病菌产生抗、耐药性(丁中等，2001;张明亮等，2019)，使防治效果下降，甚至对环境造成

39、污染，产生的农药残留也严重影响中药材的质量安全，危害人类健康。相比于化学防治技术，微生物防治植物病害因具有高效、安全、环保的优点，已逐渐成为植物病害防治的重要方法之一，是目前国内外研究重点，也是未来有机中药材生态种植的发展趋势。【前人研究进展】放线菌由于能产生大量结构多样的具有抗菌活性的抗生素，且存在于不同类型的土壤和水中，菌种资源更丰富，因而在生物防治的应用中更为广泛和有效(LeeandHwang,2002;Jungetal.,2018)。目前，放线菌用于防治作物病害的研究已有较多报道。宗兆锋等(2002)研究发现，从番茄叶片上分离获得的放线菌对7种病原真菌(大丽轮枝菌、扩展青霉菌、胶孢炭疽

40、病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉红聚端孢菌和梨状毛霉菌)具有不同程度的抑制效果;董美玉等(2008)研究表明，从土壤中分离到的放线菌ZY105对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率达85%;申哲等(2008)和涂璇等(2008)研究发现，淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黄瓜炭疽病菌等多种植物病原菌均有很好的拮抗作用;劉琴等(2020)研究表明，使用娄彻氏链霉菌SR-1102的100倍液灌根对番茄枯萎病的防治效果达72.84%;牛红杰等(2020)从黄瓜根际土壤分离得到1株小链霉菌，该菌对黄瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌)具有一定的抑制作用;汤曼利(2020)研究

41、表明，海洋放线菌梅久兰链霉菌F28对海洋细菌副溶血弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，并对其他8种病原菌具有广谱抑菌活性。放线菌对中药材根腐病抑制作用的研究有少量报道，强薇等(2014)研究发现，从人参根际土壤中筛选出的7株放线菌对人参根腐病的拮抗率达65.11%;杜用玺等(2020)研究表明，3株放线菌及其发酵液对丹参根腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超过60%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现1株放线菌津岛链霉菌(Streptomycestsukiyonensis)JT-2F对三七根腐病菌具有很强的拮抗作用(Songetal.，2020)，但尚未就该菌对三七根腐病菌的抑制作用开展

42、研究。【拟解决的关键问题】采用平板拮抗和滤纸条法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌的抑制作用，评价其对三七根腐病菌的抑制效果;在光学显微镜下观察菌株JT-2F对三七根腐病菌抑制作用的影响;利用酶联免疫分析(ELISA)法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性，以验证菌株JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用;进一步开展离体块根防效研究，从表观上证明津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病的防治作用，为三七根腐病的防控提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株供试三七叶部病害病原菌包括三七灰霉病

43、菌(Botrytiscinerea)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)和三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)，根部病害病原菌为三七根腐病菌(F.solani)，均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。供试津岛链霉菌JT-2F为广西药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株，菌株登录号MK368447。1.1.2培养基采用高氏一号培养基培养放线菌。参考仇艳肖(2010)的方法，分别制备含几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白的培养基，以检测菌株是否具有几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性。几丁质培养基：胶体几丁质5.0g,MgSO47H2O0.5g,FeS

44、O47H2O0.01g,KH2PO40.3g,K2HPO40.7g,ZnSO40.001g,琼脂20.0g,H2O1000mL,pH7.27.4。羧甲基纤维素钠(CMC)培养基：CMC-Na5.0g,MgSO47H2O0.1g,(NH4)2SO40.5g,K2HPO40.25g,琼脂20.0g,H2O1000mL。酪蛋白培养基：取5.0g脱脂奶粉加入到50mL蒸馏水中，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水，将2种溶液分开灭菌，待冷至4550时，将2种溶液混匀倒平板,即成牛奶平板。Foundationitem：GuangxiNaturalScienceFoundationJointFundingC

45、ultivationProject(2019GXNSFAA245040);TheFundforLocalScienceandTechnologyDevelopmentGuidedbytheChineseGovernment(GuikeZY20198010);YouthScienceFundationofGuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants(Guiyaoji201801);GuangxiBotanicalGardenScienceandTechnologyInnovationTeamProject(2019007)0引言【研究意义】三七Panaxnoto

46、ginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材,主要分布于广西和云南等地,具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效(国家药典委员会,2020)。目前,根腐病是三七种植面临的重要问题,主要集中在由镰孢属真菌(Fusariumspp.)引起的根腐病(董鲜等，2018;张晋豪等，2020)，其发病原因复杂,防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主,但长期使用化学农药易使病菌产生抗、耐药性(丁中等,2001;张明亮等,2019),使防治效果下降,甚至对环境造成污染,产生的农药残留也严重影响中药材的质量安全,危害人类健康。相比于化学防治技术,微生物防治

47、植物病害因具有高效、安全、环保的优点,已逐渐成为植物病害防治的重要方法之一,是目前国内外研究重点,也是未来有机中药材生态种植的发展趋势。【前人研究进展】放线菌由于能产生大量结构多样的具有抗菌活性的抗生素,且存在于不同类型的土壤和水中,菌种资源更丰富，因而在生物防治的应用中更为广泛和有效(LeeandHwang,2002;Jungetal.,2018)。目前,放线菌用于防治作物病害的研究已有較多报道。宗兆锋等(2002)研究发现,从番茄叶片上分离获得的放线菌对7种病原真菌(大丽轮枝菌、扩展青霉菌、胶孢炭疽病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉红聚端孢菌和梨状毛霉菌)具有不同程度的抑制效果;董美玉等(20

48、08)研究表明，从土壤中分离到的放线菌ZY105对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率达85%;申哲等(2008)和涂璇等(2008)研究发现,淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黄瓜炭疽病菌等多种植物病原菌均有很好的拮抗作用;刘琴等(2020)研究表明，使用娄彻氏链霉菌SR-1102的100倍液灌根对番茄枯萎病的防治效果达72.84%;牛红杰等(2020)从黄瓜根际土壤分离得到1株小链霉菌,该菌对黄瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌)具有一定的抑制作用;汤曼利(2020)研究表明,海洋放线菌梅久兰链霉菌F28对海洋细菌副溶血弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，并对其

49、他8种病原菌具有广谱抑菌活性。放线菌对中药材根腐病抑制作用的研究有少量报道，强薇等(2014)研究发现，从人参根际土壤中筛选出的7株放线菌对人参根腐病的拮抗率达65.11%;杜用玺等(2020)研究表明，3株放线菌及其发酵液对丹参根腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超过60%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现1株放线菌津岛链霉菌(Streptomycestsukiyonensis)JT-2F对三七根腐病菌具有很强的拮抗作用(Songetal.，2020),但尚未就该菌对三七根腐病菌的抑制作用开展研究。【拟解决的关键问题】采用平板拮抗和滤纸条法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶

50、部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌的抑制作用，评价其对三七根腐病菌的抑制效果;在光学显微镜下观察菌株JT-2F对三七根腐病菌抑制作用的影响;利用酶联免疫分析(ELISA)法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性，以验证菌株JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用;进一步开展离体块根防效研究，从表观上证明津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病的防治作用，为三七根腐病的防控提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株供试三七叶部病害病原菌包括三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)和三七炭

51、疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)，根部病害病原菌为三七根腐病菌(F.solani)，均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。供试津岛链霉菌JT-2F为广西药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株，菌株登录号MK368447。1.1.2培养基采用高氏一号培养基培养放线菌。参考仇艳肖(2010)的方法，分别制备含几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白的培养基，以检测菌株是否具有几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性。几丁质培养基：胶体几丁质5.0g，MgSO47H2O0.5g，FeSO47H2O0.01g,KH2PO40.3g,K2HPO40.7g,ZnSO40.001g,

52、琼脂20.0g,H2O1000mL,pH7.27.4。羧甲基纤维素钠(CMC)培养基:CMC-Na5.0g,MgSO47H2O0.1g,(NH4)2SO40.5g,K2HPO40.25g,琼脂20.0g,H2O1000mL。酪蛋白培养基：取5.0g脱脂奶粉加入到50mL蒸馏水中，另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水，将2种溶液分开灭菌，待冷至4550时，将2种溶液混匀倒平板,即成牛奶平板。Foundationitem：GuangxiNaturalScienceFoundationJointFundingCultivationProject(2019GXNSFAA245040);TheFundfo

53、rLocalScienceandTechnologyDevelopmentGuidedbytheChineseGovernment(GuikeZY20198010);YouthScienceFundationofGuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants(Guiyaoji201801);GuangxiBotanicalGardenScienceandTechnologyInnovationTeamProject(2019007)0引言【研究意义】三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材，主要分布于广西和云南等地，具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效(国家药典委员会，2020)。目前，根腐病是三七种植面临的重要问题，主要集中在由镰孢属真菌(Fusariumspp.)引起的根腐病(董鲜等，2018;张晋豪等，2020)，其发病原因复杂，防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主，但长期使用化学农药易使病菌