完整叶绿体的制备

1、完整叶绿体的制备导入叶绿体是植物营养组织中必不可少的细胞器。最显著功能是光合作用，且能合成许多植物必需的化合物半自主性细胞器，参与逆行信号转导。 今年10月，中国科学院上海植物逆境生物学研究中心研究团队，在Cell杂志上发表的研究成果揭示了叶绿体通过“逆行信号传递”过程，将外界病原体信息传递至细胞核，调节抗病基因表达，激活防御以对抗入侵者。 因此，提取完整叶绿体对于深入研究叶绿体的功能，探究与叶绿体相关的生长发育进程的分子机制具有重要作用。导入实 验 原 理实验原理提取不同的细胞器主要用到离心技术。离心是分离细胞组分和生物大分子最常见的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不

2、同离心力不同介质中沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有差速离心法和密度梯度离心法。差速离心法：差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。实验原理密度梯度离心法：密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。 不连续密度梯度离心 等密度梯度离心实验原理不连续密度梯度离心：分离的粒子的大小差别与颗粒的密度不同使其在梯度液中的沉降速度不同，通过离心力场的作用，不同的颗粒在密度梯度层内形成区带，达到彼此分离的方法。实验原理等密度梯度离心：利用颗粒的浮力密度差分离样品，密度差越大的

3、样品分离效果越好，它与颗粒大小和形状无关。实验原理本实验通过40%和85%percoll的不连续密度梯度实现完整叶绿体的分离。实验原理实 验 操 作主要试剂：1、研磨缓冲液液A（50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)、330 mM山梨醇、2 mM EDTA-Na2 (pH 8.0)、5 mM抗坏血酸、5 mM半胱氨酸;0.05%牛血清白蛋白(BSA)）2、清洗缓冲液B（50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)， 330 mM山梨醇，2 mM EDTA-Na2 (pH 8.0)）3、100% PF-Percoll0.8 g PEG 8000, 0.27 g Ficoll 400

4、000，加Percoll到27.5 mL终体积。4、Percoll梯度PF Percoll(40%或85%)，0.5 mM EDTA, 50 mM HEPES- KOH (pH 8.0)， 330 mM山梨醇。5、蛋白酶抑制剂PI母液主要试剂1、试剂和仪器准备实验操作配好试剂备好尼龙布制作PF-percoll梯度液，形成明显分层预冷水平离心机冰箱中预冷试剂2、取材、匀浆实验操作温室取材剪取叶片称重，1:10加匀浆液冰上2层尼龙布过滤1s 1下，匀浆30下获得粗提液3、不连续密度梯度离心法分离叶绿体实验操作离心清洗缓冲液B重悬样品加载吸取叶绿体含PI的清洗缓冲液B重悬保存分层水平离心离心去上清重

5、悬，重复一遍以去除percoll清洗缓冲液B重悬4、荧光显微镜检测叶绿体的完整性实验操作稀释样品分别制片镜检粗提液中除了叶绿体，还可见其他细胞器及组织；40%percoll层可见破损的和较小的叶绿体；40%-85%中间层的叶绿体完整饱满，大小均匀，蓝光和绿光激发下可见清晰荧光。实验操作温室取材剪取叶片称重5、浓度检测并分装冻存实验操作95%酒精提取酶标仪检测计算叶绿素浓度按需分装含PI的清洗缓冲液B稀释至1-3mg/ml液氮冷冻并移至-80冰箱暂存条件许可，用western blot 检测细胞器是否有污染实验操作-PS -H3MnuclearchloroplastnuclearchloroplastnuclearchloroplastMM170130957062514229221410.5注意事项注意事项实验前查阅并确认试剂配置和仪器使用方法，开展实验时要规范操作，养成良好实验习惯，也有利于获得理想的可重复的实验结果。分析与总结一组学生的实验结果，他的4个