细胞成像技术小组展示第三

1、超高分辨率荧光显微成像技术-第三小组2015.11.05STED（受激发射损耗荧光显微术）传统光学显微镜的衍射极限是/2突破光学衍射极限的方法之一是近场光学显微镜，其缺点是只能观测到细胞的表面信息STED荧光显微术是一种远场光学显微术，能够观察到细胞的三维立体结构基本原理好比用一直很粗的铅笔画细线：先画好粗线，再用橡皮擦去周边多余的部分我们在成像技术中所选择的激发光就是一直很粗的铅笔，相对应的损耗光是橡皮擦，利用损耗光擦去发光点周围的荧光强度从而减小荧光点的半径，提高分辨率激发光损耗光荧光物质发生受激辐射能级上的粒子数被消耗（粒子回到激发态）STED的原理涉及激光的非线性抑制机制。类似BOSE

2、降噪耳机，STED也是主动发射一 环形的“抑制激光”(相位和激发激光差180 度)，把本来存在在四周的荧光信号强行拉回到基态，但不产生光子。这样一来，本来一个很大的光斑就剩下中心区域一个5060nm的光斑，已经大大突破了衍射极限。Stefan Hell第一次 实现了超高分辨的光学显微技术。 STED缺点：耗损光需要很强的亮度，激光器造价昂贵，对样品损伤较大，操作起来相当繁琐， 一次只能看一块很小很小的区域，效率低。远不如现在用的PALM或STORM。注意事项及缺点激发光及损耗光的时间差及波长差要合适，保证先激发后损耗，即激发又损耗需要使用强光，能量利用率低过强的光容易引起光漂白成本偏贵适用范围

3、窄SSIM：Saturated Structured Illumination Microscopy， 饱和结构光照明显微镜 紧随STED (受激发射损耗)这项开创性工作 之后，世界各地实验室研究机构陆续出现 了一批高分辨率的显微镜技术。例如，由 珍妮莉娅法姆研究学院的物理学家兼工程 师麦茨古塔弗森 (Mats Gustafsson) 领导的 研究团队开发出了结构光照明显微镜 (structuredillumination microscopy, SIM ) 。 利用莫尔条纹原理，将栅栏状的光条纹重 叠，产生衍射图像，再利用数学的方法把 衍射图像还原成真实的图像。SSIM改变光学的点扩散函数来

4、突破光学极限的另一个方法是利用饱和结构照明显微技术(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM) SSIM技术的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息.莫尔条纹是一种常见的光学现象，只要把周期性 的条状图案重叠就可以观察到。莫尔条纹是18世纪法国研究人员莫尔先生首先发现的一种光学现象。从技术角度上讲，莫尔条纹是两条线或两个物体之间以恒定的角度和频率发生干涉的视觉结果，当人眼无法分辨这两条线或两个物体时，只能看到干涉的花纹，这种光学现象中的花纹就是莫尔条纹。莫尔条纹能从三个方面产生：1. 双色或多色网点

5、之间的干涉；2. 各色网点与丝网网丝之间的干涉；3. 作为附加的因素，由于承印物体本身的特性而发生的干涉。使用莫尔条纹防护系统的目的就在于根据你选定的丝网目数、加网线数、印刷色数和加网角度来预测莫尔条纹。莫尔条纹以透射光栅为例，当指示光栅上的线纹和标尺光栅上的线纹之间形成一个小角度，并且两个光栅尺刻面相对平行放置时，在光源的照射下，位于几乎垂直的栅纹上，形成明暗相间的条纹。这种条纹称为“莫尔条纹” 。如果知道b的结构及a+b所叠加的莫尔条纹c，将不能探测的高频转 化为能探测的低频，就能够反推出a所携带的精细结构信息。 即使a、b图逐渐缩小， 里面的高频条纹已经不可见了，但是在c中的莫尔条纹仍可

6、以清楚地分辨，这就是 SIM的精义。结构光照明技术（SIM） 基于结构照明原理的超高分辨率技术是美国科学家麦茨古塔弗森 (Mats Gustafsson) 在2000年发明的，非常适于细胞研究，分辨率提高了一倍。这个技术基于两个高 空间频率的图案重叠可以形成低频率莫尔条纹的原理，通过解析莫尔条纹实现超 高分辨率成像。单分子荧光定位超分辨显微成像技术荧光显微成像的极限显微镜的分辨率定义为显微镜可以分辨出来的两个同等亮度的点光源之间的最小距离显微镜分辨率的极限是由光的衍射特性决定的点光源经过透镜组及物镜后在焦平面上形成模糊的光斑光斑大小是入射光的波长，n是介质的折射系数，是物镜的半孔径角度，而NA

7、则是物镜的数值孔径 对比度分辨率不仅与半高宽有关而且与成像的对比度有关对比度：在两个同样亮度的点光源光斑中间存在亮度的最小值，而点光源光斑中心为亮度的最大值，两值之差与亮度最大值得比值即为对比度。通过重复扫描目标样本，并在每次拍摄时只让少量分子发光，最后把 所得图像重迭在 起 得到突破“衍射极限 的高分辨率 微影像 所得图像重迭在一起，得到突破“衍射极限”的高分辨率显微影像。 Eric Betzig PALM Betzig 庄小威 STORM 2006年，超高分辨率显微镜研究翻开了新的篇章。Eric Betzig、 庄晓威科研小组几乎同时报道了他们提高显微镜分辨率 的科研成果。贝齐格(Betz

8、ig)的PALM技术与庄小威的STORM技术虽然叫法不同，但都是利用 了荧光分子的可调控性原理 ,论文也是在2006年差不多的时间发表 。PALM绿色荧光蛋白（GFP)的变种（PA-GFP)特性：在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光利用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性可以突破光学分辨率的极限PALM用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子在确定这些分子的位置后，再长时间使用

9、488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术 PALM的不足PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力 STORM基本原理传统成像由于分子同时受激发，同时发光，导致艾里斑互相重合，无法分辨单个分子。 STORM成像，每次样品中仅有少量随机、离散的单个荧光分子发光。由于距离较远，

10、 艾里斑不会互相重合 通过标记中心可以识别单个荧光分子；通过拟合，找出每个荧 光分子中心点的位置。重复拍摄多张照片之后，就可以把所有荧光分子的中心点位置 叠加起来形成整幅图像。STORM的优势STORM也可以实现延时拍摄。(1.线粒体的融合和分裂过程。由于STORM成像的分辨率很高，所以可以进行定性 以及精确的定量统计。比如线粒体的宽度等。2.内质网的管网状结构的动态变化过程。非常直观地看到ER tubule的伸长过程。)STORM 还能实现多色标记。(science上发表文章，利用 电镜技术，确实可以看到ER tubule为线粒体的分裂标记了 位置。)STORM的不足由于用抗体来标记内源蛋白

11、并非一对一的关系，所以STORM不能量化胞内蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量 Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM)Providing us with eyes for the nanoworldThe Original Idea of NSOM Schematic representation of Synges idea for achieving subdiffraction limit spatial resolution. Incident radiation is passed through a small, subw

12、avelength hole in an opaque screen. By the positioning of the screen close to the sample, the emerging radiation is forced to interact with the sample before diffracting out. The evanescent field from the aperturedecays rapidly, illuminating only the near-field.Comparison of far-field and near-field

13、 imaging of a sample Far-field imaging: the light source or light-collecting element is separated from the sample by a distance, h, the wavelength of light used for illumination. Light is diffracted so that the area illuminated isthan the aperture. Sub details of the image are lost. Near-field imagi

14、ng: the optics are separated from the sample by a distance, h. The area illuminated corresponds well with the aperture of the optics.Basic Concept of NSOM Near-field microscopes circumvent the diffraction barrier by exploiting the unique properties of evanescent waves. In practice, the nanosized det

15、ector aperture is placed adjacent to the specimen at a distance much shorter than the illumination wavelength (giving rise to the term near-field) to detect non-propagating light waves generated at the surface.The Greatest Advantage of NSOM Resolution is limited only by the physical size of the aper

16、ture rather than the wavelength of illuminating light, such that lateral and axial resolutions of 20 nanometers and 2 to 5 nanometers, respectively, can be achieved.The Disadvantages of NSOMVery low working distance and extremely shallow depth of field.Limited to study surfaces.Not conducive for studying soft materials, especially under shear force mode.Long scan times for large sample areas for high resolution imaging.Problems Restricting the Use of NSOM in BiologyProvision of adequate lightFormation of small aperturesControl of p