核酸含量测定定磷法

1、核酸含量测定定磷法1第1页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四核酸定量测定常见的方法1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为-羟-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。2第2页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四定磷法的原理

2、首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为： (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 MoO3（钼蓝）Vit C3第3页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在125g 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1g RNA磷相当于10.5 g RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。4第4页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四试

3、剂酵母RNA样品溶液：2000g/mL标准磷原液：含磷量为1000 g/mL标准磷溶液：含磷量为10 g/mL，每组用干试管取15mL定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL5第5页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四实验步骤1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；2. 制定定磷标准曲线；3. 测定回收率和样品总磷量。6第6页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四1. 样品消化（每两组或三组做一份）消化管123RNA/mL010标准磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/L H2SO4/m

4、L222消煮炉中消化26h至溶液无色透明，冷却dH2O/mL111沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却用dH2O定容/mL505050混匀7第7页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作： 12 3456标准磷溶液/mL 00.10.20.30.40.5dH2O/mL 1.51.41.31.21.11.0定磷试剂/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 用漩涡混合器混匀，45恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值A660(1) A660(2) A660平均值 A6

5、60平均值空白 08第8页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四 3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）7（空白）8（样品）9（标准）定容溶液/mL 1.51.50.15dH2O/mL 001.35定磷试剂/mL 1.5 1.5 1.5 用漩涡混合器混匀，45恒温水浴保温25分钟 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值空白 09第9页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四数据处理关于空白： 16号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。 79号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。 以每管含磷量(g)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲

6、线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(g)。10第10页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四计算回收率： (2) 计算样品总磷量： (3) 计算RNA量： (4) 样品RNA含量：11第11页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四操作注意事项1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样；2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；3. 每管加样和测定均要求平行操作；4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样；5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。 12第12页，共14页，2022年，5月20日，5点27分，星期四思考题1. 回收率的意义；2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。13第13页，共14页，2022年，5月20日，5点27分