肿瘤细胞迁移实验讲义

1、（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异样、瘤细胞拥有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特点，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威迫患者健康以致生命的主要原由。所以研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发活力制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学种类同样的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。图1肿瘤转移表示图依据肿瘤异质性理论，大部分恶性肿瘤最先虽属单克隆发源，但它在不停增殖演进至临床显然的肿瘤时，因为瘤细胞遗传性状的不稳固性(来自基因突变或缺失等)而不停地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表

2、型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型以致对激素的反响性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群拥有被此不一样的特征即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接相关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，拥有高转移潜能的筋细胞易发生转移。肿瘤细胞的运动性，根源于细胞运动“接触克制”的观点。经过体外培育正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在挪动过程中惹起的皱栖脑膜与其余细胞的表面接触时，常常产生细胞膜活动的克制和挪动中细胞的缩短，而后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上交融形成一单层时，细胞运动即明显遇到克制。间变的瘤子细胞则缺少接触克制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细

3、胞所克制。针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各样抗转移药物，如血小板凝聚克制剂、血管生成克制因子、内皮稳固因子、扰乱素以及其余化学药物。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特征的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培育的单层细胞上，划痕致伤，而后加入药物察看其克制肿瘤细胞迁徙的能力。下列图即为划痕实验的表示图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，由于药物的作用使细胞迁徙遇到克制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁徙能力，在一段时间后经过迁徙将划痕掩饰(C)。ABC图2实验结果（A表示在单层细胞上划出的一道痕；B表示加入克制剂，为阳性比较组；C表示未加入克制剂，

4、为阴性比较组）一、实验目的1认识肿瘤细胞转移的基根源理2认识测定细胞运动特征的方法细胞划痕法二、实验原理肿瘤细胞在体外仍拥有迁徙的能力，本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特征。三、仪器和试剂1）细胞系及其培育：肝肿瘤细胞HepG22）24孔板，移液器，倒置显微镜，3）主要试剂：PBS，DMEM培育液，%胰酶，胎牛血清，5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）四、实验步骤5-氟尿嘧啶溶液的配制精细称取10mg用灭菌蒸馏水溶解，定容于100ml容量瓶，精细移取1ml溶液，稀释至100ml，即得1ug/ml5-氟尿嘧啶溶液。2制备单层细胞将细胞密度为510105个/mL的

5、HepG2细胞铺于24孔板（每孔500uL）上，加入含10胎牛血清的培育液，培育1624h,使形成单层细胞。3划痕以五氟尿嘧啶（5Fu）为例，第一配制1g/L的母液，取45L该母液用PBS稀释至mL，获得浓度为40g/ML的5Fu溶液。用10uL移液枪枪头（或许无菌牙签）在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS冲洗3次，而后加入上边配好的5Fu溶液，平行两个样本，孵育24h后换成含10胎牛血清的培育液，孵育24h。4察看并摄影吸去培育液，用PBS冲洗3次后，在倒置荧光显微镜下察看并摄影。五、注意事项：1实验时应注意细胞生长情况，选择适合的细胞接种浓度。对不一样的细胞要察看细胞的贴壁率等，确立实验时

6、细胞的接种数目和培育时间，保证培育停止时密度适合。2在用PBS缓冲液冲刷时，注意贴壁慢慢加入，免得冲散单层贴壁细胞，影响实验摄影结果。3在药物的挑选过程中，其对细胞迁徙能力的影响也是重要的一方面。实验设计过程中需要选择适合的阳性比较组和阴性比较组。六、思虑题怎样用实验考证化学物质能恢复或许加强细胞的迁徙能力？怎样防止化学物质浓度过高造成的细胞毒性对实验的影响？七、参照文件：1司徒镇强，吴军正；细胞培育；兴界图书第一版企业；2004年3月第1版2MaryBirch,StephenMitchell,andIanR.andCharacterizationofHumanMelanomaCellVariantsExpressingHighandLowLevelsofCD44.CANCERRESEARCH1991;51:6660-6667.3何贤峰，杨述华等.唑来膦酸对骨血瘤细胞生物学行为的影响.肿瘤