基因工程第六章

1、基因工程第六章第1页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。 第2页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。

2、目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。 第3页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.1 利用表型特征选择（遗传检测法） 表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。 第4页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.1.1 利用载体提供的表型特征选择重组体分子 1. 抗药性标记插入失活选择法 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在

3、pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因内有Bam HI和Sal I两种限制酶的单一切点。在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，因而根据AmprTets表型即可筛选出在Tetr基因内带有插入DNA片段的重组体细胞。 第5页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二第6页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 利用环丝氨酸富集法可以简化这种插入失活检测法的程序，该法可以使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，从而抑制不含有插入DNA片段的载体分子形成转化子。例如： 当

4、外源DNA 插入在pBR322质粒的四环素抗性基因(Tetr)上，该基因便会立即失去它的功能作用，而另一种抗菌素抗性基因氨苄青霉素基因(Ampr)，则仍然是完整的。将转化的细菌培养物移至含有氨苄青霉素的培养基中生长，经过这样的选择作用而得以存活下来的所有细胞，都应该带上了pBR322质粒分子。 第7页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 在这些pBR322质粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列内具有DNA插入片段的重组质粒。把这种富集了的培养物作适当的稀释后，转接到含有四环素的培养基中生长，于是在其pBR322质粒分子的Tetr基因序列中带有DNA插入片段的所有细胞，都将

5、停止生长（注意：四环素不会使细胞死亡，只是抑制细胞的生长）。最后加入环丝氨酸，就会促使所有正在生长着的细胞发生溶胞反应，那些没有发生溶胞反应而存活下来的细胞，大约有90100%都带有pBR322重组质粒，且在其Tetr基因上都含有一个插入的外源DNA片段，这些细胞可通过离心作用收集起来。 第8页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中，也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6

6、.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失活后，AmprTets菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。第9页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二第10页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 这种方法的优点是无需把每一个转化子接种在Amp和Tet平板上，直接在转化平板上即可鉴定。其缺点是由于把指示液直接加入选择平板内，极易超成菌落之间的相互污染，给其后的鉴定带来困难。目前使用纸片法使这一方法得到了改善：预先将一定大小的纸片浸泡在指示液中，干燥后

7、密闭保存，使用时只要将纸片覆盖在转化平板上，数分钟内就可以观察到结果。 第11页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 将pUC质粒转化的细胞，培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物，使菌落呈现出蓝色反应。 当pUC质粒载体的lacZ 序列插入了外源DNA片段时，会阻断读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。 第12页，共35页，2

8、022年，5月20日，12点7分，星期二 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征选择重组体分子 这种选择法要求所克隆的DNA片段是一个完整的序列，而且能够在大肠杆菌中实现功能的表达。其依据的基本原理是：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。例如小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）的分离： 第13页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制剂反转录成cDNA拷贝，构建cDNA基因文库。根据小鼠DNFR对于药物三甲氧苄二氨嘧啶呈现抗性这种性状

9、特征，将转化的细菌生长在含有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄主细胞新的抗性表型所致。 第14页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子 把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区；二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不会包装成活的噬菌体颗粒的。第1

10、5页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 经体外包装，转导后能否形成清晰噬菌斑，尤其是对替换型载体，本身就是一种可利用的选择标记。 另外cI基因插入失活后，会诱发溶源性细菌的原噬菌体进入溶菌周期，根据产生噬菌斑的清晰与混浊，也可以进行选择。第16页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.2 利用核酸杂交筛选 从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术。它所依据的原理是放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交，利用同源DNA碱基配对的原则检测特定的重组克隆。第17页

11、，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 核酸杂交筛选法的最大优点是它可以普遍广泛地应用，尤其适合于大量群体的筛选，只要有现成可用的特异性探针，就可以有效地检测任何一种插入的外源DNA序列，而不以这种序列能否在大肠杆菌中实现基因表达为前提。第18页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.2.1 原位杂交筛选 生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原来的位置不变地影印在硝酸纤维素滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，而将母板很好地保存起来。因为变性DNA同硝酸纤维素滤膜有很强的亲和力，便在膜上形成DNA的印迹，在80下烘烤滤膜，使DNA牢固地固定下来

12、。第19页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 用放射性同位素标记的RNA或DNA为探针同滤膜上的菌落所释放的变性DNA杂交，并用放射自显影技术进行检测，凡是含有与探针互补序列的菌落DNA，就会在X光胶片上出现曝光点。根据曝光点的位置，便可以从保留的母板上相应位置挑出所需要的阳性菌落或噬菌斑，这就是所需要的含有目的基因插入片段的重组体克隆。第20页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.2.2 核酸杂交检测的探针 进行核酸分子杂交的前提是要有特定的DNA或RNA作探针。具有一定已知序列的核酸片段，大小通常为20kb左右，再带上一定的探测标记，就构成了核酸探

13、针。它可以通过分子杂交与待测基因的DNA序列结合，产生杂交信号，从而把待测基因的质和量显示出来。第21页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 1. 放射性探针 广泛使用的探针，多是以32PdNTP为标记前体，通过缺口转移的方法，把天然DNA或RNA片段标记上放射性同位素。 此外还可以化学合成DNA探针，只要已知目的基因产物的部分氨基酸序列，就可以从这个信息中，反推出基因编码区可能的核苷酸排列顺序。选择一小段含有独特密码子（Met和Try）或简并性最小的密码子（Cys、His、Phe和Tyr等）的氨基酸序列，用化学法合成出相当于这些密码子序列的寡核苷酸片段（1020个碱基）混和

14、物；然后利用多核苷酸激酶，将32PdNTP转移到合成的DNA的5-OH末端（称为末端标记 ），即成为标记好的探针。第22页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二一个密码子： Met （甲硫氨酸） AUG Try （色氨酸） UGG二个密码子： Cys （半胱氨酸） His （组氨酸） Phe （苯丙氨酸） Try （酪氨酸） Lys （赖氨酸） 第23页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 2. 非放射性探针 由于32P放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且对人体有一定的损害，因而近年来又研制了非放射性物质标记核酸的方法，如糖基化探针、生物素探针、毛地

15、黄苷标记等。 用生物素标记DNA形成探针是目前用得较多的一种，它可以采用酶促或光促生物素来标记核酸。酶促法是利用缺口转移的方法，但标记前体不是32PdTTP，而是用嘧啶环C5位连接了生物素的dTTP（或dUTP），它可以有效地掺入DNA中形成生物素探针。第24页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 光促法使用的试剂为光敏生物素乙酸盐，它是由光敏基团、连接臂和生物素组成的。光敏基团可在光照下活化，与核酸的碱基结合，连接臂可以降低生物素基团对核酸杂交的空间位阻；生物素用做标记物。将待标记的核酸（DNA或RNA）与光敏生物素乙酸盐混合，在近紫外的光源（如高压汞灯、碘钨灯）下照射15

16、20分钟，就可将生物素标记在单链或双链的DNA或RNA上，形成稳定的共价结合。第25页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 标记好的生物素探针，可用于核酸的杂交反应，然后用亲和素-酶系统来显示。亲和素可以特异地与生物素结合，酶可与底物反应进行显色或化学发光，这就相当于放射性同位素探针杂交后的放射自显影。最常用的工具酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。 非放射性方法进行核酸杂交，其灵敏度不如放射性方法高，但非放射性探针具有安全、稳定、使用方便等优点，是一种正在发展很有前途的方法。第26页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 6.3 利用免疫学方法

17、筛选 免疫学方法专一性很强、灵敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主细胞中的表达产物（多肽）作抗原，以该基因产物的免疫血清作抗体，通过抗原抗体反应将目的基因克隆检出。 免疫学方法可以分为两种：即放射性抗体测定法和免疫沉淀测定法。这些方法最突出的优点是，它们直接检测重组克隆所表达的蛋白产物，能够检测无任何可供选择的表型特征的重组克隆。当然这种方法必须具备有效的特异性抗体。第27页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二6.3.1 放射性抗体测定法 这一方法所依据的原理为： (1) 一种免疫血清含有好几种特异性抗体（IgG），它们识别抗原分子上的不同定子，并分别同各自识别的抗原定子

18、相结合； (2) 抗体分子或抗体的F(ab)部分，能够十分牢固地吸附在固体基质（如聚乙烯等塑料制品）上，而不会被洗脱掉； (3) 通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素125I标记上。第28页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二 放射性抗体测定的主要程序是：(1) 首先把转化的菌落涂布在平板上，长出菌落以后，再影印到另一块平板上继续培养，并保留原来的平板作为母板；(2) 待影印平板上的菌落长好后，置于含有氯仿饱和气体的容器中使菌落裂解，阳性菌落便释放出抗原；(3) 将吸附了未标记IgG抗体的聚乙烯薄膜覆盖在平板表面，如果抗原与抗体具有对应关系，则在薄膜上形成抗原-抗体复合物；第29页，共35页，2022年，5月20日，12点7分，星期二(4) 取下聚乙烯薄膜，再用125