脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性

1、脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性唐蕾徐磊韩跃毛洪【摘要】以开端纯化的叶绿素为质料，使用叶绿素酶水解、选择性酸落解两种要领制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱阐发表现两种要领得到的产物图谱相似，酸落解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌实行表白脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌结果，对革兰阴性菌和酵母无显着作用。【关键词】脱镁叶绿酸；叶绿素酶；高效液相色谱；光敏抗菌活性KEYRDSPhephrbide;hlrphyllase;Highperfraneliquidhratgraphy;Phtsensitiveantiirbialativity光敏剂是一些具有光活性的化合物，可以选择性地富集在特定的构造，在紫

2、外或可见光的引发下，产生光动力杀伤作用，起到杀菌和治疗肿瘤的成果。比年来，由于抗生素的滥用所引起的毒副作用、耐药菌的出现和天然微生物群落的粉碎，使得天然、环境友爱、可以或许有用地杀灭有害菌而不伤及相近构造的光敏剂颇受存眷1。脱镁叶绿酸(Pheide)作为卟啉类光敏活性剂具有布局明白、不变，在红外区有较强的汲取，光敏活性更有用等特点，在癌症的光敏动力学治疗中已有报道24，但其光敏杀菌作用尚待探究。别的，脱镁叶绿酸作为叶绿素(hl)的中心落解产物在植物中很少积聚，分散困难，但可以通过叶绿素的酶促水解和酸落解法得到5，6。基于上述阐发，本文对酶法和酸法叶绿素落解产物举行了比力，并研究了其对细菌和酵母

3、的光敏活性。1质料与要领细菌产气肠杆菌(Aerbateraergenes)、金葡菌(Staphylusaureus)、四联球菌(irustetraglnus)、枯草芽孢杆菌(Baillussubtillis)、北京棒杆菌(rynebateriupekinese)、白葡萄球菌(Staphylusalbus)、大肠埃希菌(Esherihiali)。均为实行室收藏菌种。1.2造就基及造就条件酵母造就基酵母膏5g，卵白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000l，pH6.0。细菌造就基Nal5g，卵白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000l，pH7.0。121灭菌20in。造就温度酵母28，细菌37，光照为

4、造就箱内置光源。1.3抗菌实行(1)在固体平板上匀称涂布200l菌液，取10l待测样品溶液于直径6的滤纸片上，稍干后贴于已接菌的琼脂造就基外貌，光照条件下恒温造就24h，不雅察、记载抑菌圈巨细，并与阳性比拟药物(细菌为氨苄西林，酵母为放线菌酮)比拟力，每个处置惩罚设3个重复。(2)将待测菌在含有50g/l的Pheide造就基上十字划线，比力光、暗条件对微生物生长的影响，每个处置惩罚设3个重复。1.4叶绿素的提取参照Iriyaa法7，从菠菜中提取和纯化叶绿素，丙酮溶解，测定溶液在645和663n处的吸光值，根据Arnn公式盘算叶绿素含量：hlA(g/l)=0.0127A663-0.00269A6

5、45hlB(g/l)=0.0229A645-0.00468A6631.5脱镁叶绿酸的制备1.6高效液相色谱条件2结果与讨论2.1脱镁叶绿酸的制备脱镁叶绿酸作为天然卟啉是叶绿素落解的中心产物，在茶叶、柑橘、老化叶中普及存在，但含量低，分散困难。一样平常通过叶绿素酶催化，植醇基水解，得到脱植醇叶绿素，继而酸化得到脱镁脱植醇叶绿酸即PhEide(图1)。由于疏水性植醇基的去除，Pheide的亲水性大大增长，可以通过液液分散将底物hl与产物Pheide分散。由于hlA和hlB同时可以作为叶绿素酶的底物，因此产物中除PheideA外还常含有少量的PheideB。Hynninen等6根据hlA、B植醇基水

6、解本领的差异，开拓了直接从hlA、B混淆物通过选择性酸落解制备PheideA的要领。图2为菠菜色素的粗提液，颠末Iriyaa法纯化得到hlA、B，和选择性酸落解产物的薄层层析结果。得到的产物条带经质谱阐发表现分子量为592与PheideA同等。高效液相色谱是检测叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等色素的常用阐发本领，本研究用反相高效液相色谱，选择叶绿素和类胡萝卜素的检测波长430n比力两种制备要领，图谱表现两者的结果相似，此中选择性酸落解的纯度较高(图3)。2.2脱镁叶绿酸抗菌实行我们起首选择实行室保存的5种细菌和6种酵母举行了光敏抑菌实行，结果表白脱镁叶绿酸对革兰阳性菌有显着的抑菌作用，但对革兰阴性菌和酵母没有按捺作用(表1)。为了进一步验证该结果，以多种细菌(产气肠杆菌、金葡菌、四联球菌、北京棒杆菌、枯草芽孢杆菌、白葡萄球菌、大肠埃希菌)为工具，比力了光照和暗中造就条件下细菌的生长环境，创造光照明显按捺了革兰阳性菌的生长(图略)。该结果与别的卟啉类化合物所得的结果同等810。制备要领(酸法和酶法落解)对所得的结果没有明显影响。3结论天然光敏抗菌剂在办理抗生素的毒副作用和抗生素耐药性、选择性杀灭有害菌和庇护天然微生物群落方面具有上风。叶绿素泉源普及，其卟啉