1500L哺乳动物细胞生产线工艺描述 ―细胞培养部分 ―蛋白纯化部分VIP

1、P 45/451500L哺乳动物细胞生产线工艺描述细胞培养部分蛋白纯化部分Process Summary for 1500L Mammalian Cell Train目录 TOC o 1-2 h z u HYPERLINK l _Toc332615136 Process Block Flow Diagram PAGEREF _Toc332615136 h 4 HYPERLINK l _Toc332615137 1Media Preperation PAGEREF _Toc332615137 h 5 HYPERLINK l _Toc332615138 1.1WeightCheck PAGEREF

2、 _Toc332615138 h 5 HYPERLINK l _Toc332615139 1.2Air filter FG1064无菌空气过滤器 PAGEREF _Toc332615139 h 5 HYPERLINK l _Toc332615140 1.3Cool WFI Prep. PAGEREF _Toc332615140 h 5 HYPERLINK l _Toc332615141 1.4Small volume Media Prep. PAGEREF _Toc332615141 h 6 HYPERLINK l _Toc332615142 1.550L Media Prep. PAGERE

3、F _Toc332615142 h 6 HYPERLINK l _Toc332615143 1.6400L Media Prep. PAGEREF _Toc332615143 h 8 HYPERLINK l _Toc332615144 1.71200L Media Prep. PAGEREF _Toc332615144 h 10 HYPERLINK l _Toc332615145 2Cell Culture PAGEREF _Toc332615145 h 13 HYPERLINK l _Toc332615146 2.1Seed recovery PAGEREF _Toc332615146 h

4、13 HYPERLINK l _Toc332615147 2.2Seed Propagation PAGEREF _Toc332615147 h 13 HYPERLINK l _Toc332615148 2.310L wave Bioreactor PAGEREF _Toc332615148 h 13 HYPERLINK l _Toc332615149 2.460L Bioreactor PAGEREF _Toc332615149 h 13 HYPERLINK l _Toc332615150 2.5300L Bioreactor PAGEREF _Toc332615150 h 14 HYPER

5、LINK l _Toc332615151 2.61500L Bioreactor PAGEREF _Toc332615151 h 14 HYPERLINK l _Toc332615152 2.7组件清洗 PAGEREF _Toc332615152 h 14 HYPERLINK l _Toc332615153 2.8组件灭菌 PAGEREF _Toc332615153 h 14 HYPERLINK l _Toc332615154 3Harverst PAGEREF _Toc332615154 h 15 HYPERLINK l _Toc332615155 3.1Centrifuge PAGEREF

6、 _Toc332615155 h 15 HYPERLINK l _Toc332615156 3.2Filter PAGEREF _Toc332615156 h 15 HYPERLINK l _Toc332615157 3.3离心机及收获管路清洁 PAGEREF _Toc332615157 h 15 HYPERLINK l _Toc332615158 3.4收获罐SIP PAGEREF _Toc332615158 h 15 HYPERLINK l _Toc332615159 3.5收获 PAGEREF _Toc332615159 h 15 HYPERLINK l _Toc332615160 3.

7、6收获罐CIP PAGEREF _Toc332615160 h 16 HYPERLINK l _Toc332615161 3.8收获罐冷却 PAGEREF _Toc332615161 h 16 HYPERLINK l _Toc332615162 4UF PAGEREF _Toc332615162 h 17 HYPERLINK l _Toc332615163 4.1冷注射用水准备 PAGEREF _Toc332615163 h 17 HYPERLINK l _Toc332615165 4.3UF系统使用前消毒 PAGEREF _Toc332615165 h 19 HYPERLINK l _Toc

8、332615168 4.4UF 开始操作 PAGEREF _Toc332615168 h 20 HYPERLINK l _Toc332615181 5亲和层析 PAGEREF _Toc332615181 h 21 HYPERLINK l _Toc332615182 5.1层析缓冲液(buffer2)准备 PAGEREF _Toc332615182 h 21 HYPERLINK l _Toc332615183 5.2层析缓冲液（buffer 3）准备 PAGEREF _Toc332615183 h 22 HYPERLINK l _Toc332615187 5.3层析缓冲液（buffer 4）准备

9、 PAGEREF _Toc332615187 h 23 HYPERLINK l _Toc332615189 5.4层析缓冲液（buffer 5）准备 PAGEREF _Toc332615189 h 24 HYPERLINK l _Toc332615191 5.5层析缓冲液（buffer 6）准备 PAGEREF _Toc332615191 h 25 HYPERLINK l _Toc332615192 5.6层析缓冲液（buffer 7）准备 PAGEREF _Toc332615192 h 26 HYPERLINK l _Toc332615193 5.7亲和层析操作 PAGEREF _Toc33

10、2615193 h 27 HYPERLINK l _Toc332615205 6病毒灭活 PAGEREF _Toc332615205 h 29 HYPERLINK l _Toc332615206 6.1产品pH酸性调节，开始低pH病毒灭活 PAGEREF _Toc332615206 h 29 HYPERLINK l _Toc332615207 6.23个小时以后将产品的pH调节到中性，病毒灭活结束。 PAGEREF _Toc332615207 h 29 HYPERLINK l _Toc332615208 6.3搅拌5分钟取样。 PAGEREF _Toc332615208 h 29 HYPERL

11、INK l _Toc332615209 6.4产品稀释 PAGEREF _Toc332615209 h 29 HYPERLINK l _Toc332615210 6.5产品降温 PAGEREF _Toc332615210 h 29 HYPERLINK l _Toc332615211 6.6product transfer line CIP（从purification hold tank到层析系统） PAGEREF _Toc332615211 h 29 HYPERLINK l _Toc332615212 6.7buffer transfer line CIP（从buffer hold tank（

12、VE1214）到purification hold tank） PAGEREF _Toc332615212 h 29 HYPERLINK l _Toc332615213 7阳离子层析 PAGEREF _Toc332615213 h 30 HYPERLINK l _Toc332615214 7.1层析缓冲液（buffer 9）准备 PAGEREF _Toc332615214 h 30 HYPERLINK l _Toc332615218 7.2层析缓冲液（buffer10）准备 PAGEREF _Toc332615218 h 31 HYPERLINK l _Toc332615221 7.3层析缓冲

13、液（buffer11）准备 PAGEREF _Toc332615221 h 32 HYPERLINK l _Toc332615223 7.4阳离子层析操作 PAGEREF _Toc332615223 h 33 HYPERLINK l _Toc332615233 8阴离子层析 PAGEREF _Toc332615233 h 35 HYPERLINK l _Toc332615234 8.1层析缓冲液（buffer 12）准备 PAGEREF _Toc332615234 h 35 HYPERLINK l _Toc332615237 8.2层析缓冲液（buffer14）准备 PAGEREF _Toc3

14、32615237 h 36 HYPERLINK l _Toc332615239 8.3阴离子层析操作 PAGEREF _Toc332615239 h 37 HYPERLINK l _Toc332615248 9UF PAGEREF _Toc332615248 h 38 HYPERLINK l _Toc332615249 9.1冷注射用水准备 PAGEREF _Toc332615249 h 38 HYPERLINK l _Toc332615252 9.2超滤置换缓冲液（buffer15）准备 PAGEREF _Toc332615252 h 39 HYPERLINK l _Toc332615254

15、 9.3UF系统使用前消毒 PAGEREF _Toc332615254 h 40 HYPERLINK l _Toc332615259 9.4UF 开始操作 PAGEREF _Toc332615259 h 41 HYPERLINK l _Toc332615269 10除菌过滤 PAGEREF _Toc332615269 h 42 HYPERLINK l _Toc332615270 10.1除菌过滤操作 PAGEREF _Toc332615270 h 42 HYPERLINK l _Toc332615272 10.2超滤系统清洗 PAGEREF _Toc332615272 h 42Process

16、Block Flow Diagram WCB and Inoculumn Prep.Media PreperationAnion ExchangeCation ExchangeHarvestBuffer HoldingVirus InactivationCell CultureNFUF Affinity ChromatographyProductSterile FiltrationUF Buffer Preperation Cell Culture Process DescriptionMedia Preperation WeightCheck将仓库称量准确的物料经外包装处理后通过物料通道进入

17、培养基配制间重量确认数据上传，位置靠近CCS HMIAir filter FG1064无菌空气过滤器 SIPOff-line integrity test:关闭V03，将housing从主管路上拆下来，用新滤芯替换旧的滤芯，按照SOP用合适的纯化水润湿后再进行完整性测试。测试完成后再将其安装到主管路上。SIP：从纯蒸汽主管路进行在位SIP,疏水阀，压力表，冷空气排放/1，冷凝水排放：XV 02一直疏水，XV13，XV24，XV37开一段时间疏水，根据温度自动决定是开ST/01。2，过滤器SIP：打开过滤器手动阀V03，CCS提醒过滤器排气阀V07开一段时间，打开XV25，经过102到103图冷

18、凝水排放点，XV18是自动阀（此阀在SIP及取水时有反馈，安全互锁），CCS有小量WFI取用PHASE。Operation管道低压气体保压打开PA自动阀门，进行通气，SIP完后，打开XV23，打开气体吹干管道，关闭相关阀门。Cool WFI Prep.使用前冲洗WFI flushing，WFI进到三个培养基配制罐的管路清洗是通过WFI冲洗到罐，然后直排。管道通入空气保压* note：所有WFI的使用点XV02涉及到的PHASE应与WFI管路SIP的PHASE互锁SIP热交换器独立灭菌PHSAE ：SIP时夹套冷却水不排放。关冷却水进阀XV04，回水自动控制阀控制disabled，但TCV01控

19、制阀开到100%，冷却水回水阀XV10（手动阀）持续开。确认XV25关闭，然后通纯蒸汽SIP，打开XV14，XV26，XV01，SIP直到103增加的冷凝水排放点。热交换器回水应保持一定反压，防止夹套内冷却水蒸发过快干掉。热交换器与其到对应配制罐的管道一同SIP的PHASE:在2的基础上，再打开XV05，XV06，XV17，蒸汽最后进入细胞罐冷凝排放（101），102及103类似（SIP可选择1200L，400L，50L这3个罐任意1个，2个，3个组合）。4，SIP完成后，通入空气吹干WFI CoolingSIP结束后开始冷却WFI前，Enable回水自动控制阀TCV01控制，再开冷却水进阀（

20、自动阀）XV04。打开XV02 接通WFI，进行WFI出水温度自动控制，若温度不合格，则通过103增加的冷凝水排放点直排。等WFI水温合格后，再打开通道阀门XV05，XV06，XV17进罐（101），102及103类似。Small volume Media Prep.WFI获取WFI热交换其除有3条硬管连接3个media配制罐外，还有一个用水点用于人工获取冷WFI。单独的取水PHASE,安全角度考虑，在此管道有蒸汽或水时尤其要注意。通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排。向桶中注入足量合适温度的WFI。配制在20L配制桶内称取90%所需量WFI后，开启搅拌，向桶内慢慢

21、加入称量好的meida粉剂，加各种营养成分，调pH，定容，搅拌完成后，取样中控检测。Ph,温度及重量可实时上传，中控检测指标及搅拌，等可手动输入上传确认。PH计位置可根据配制量5L20L进行高度调整。有防止粉末飞扬保护罩。将配液桶及搅拌桨等用纯化水清洗，泡碱，WFI冲洗干净准备pH计，酸碱等通过称重向另一配液桶中注入9095%的WFI开启搅拌将称好的培养基倒入桶中调节PH，记录温度。因为是手动调节，所以注意pH调节泵开关与罐pH值显示距离要近，可边看边调。取样手动清洗清洗在清洗间手工清洗，除热原，WFI Rinse等50L Media Prep.Filters installation and

22、 integrity test呼吸器气体滤芯FG1061Media初过滤芯（初过滤器旁边预留电源插头，方便移动蠕动泵使用）Tank RinseHot WFI Rinse（此时热交换器温控disble）若距离前一次CIP后放置时间不长，则需要Hot WFI Rinse，。打开XV01，XV02，XV03通过喷淋球进罐，然后通过底阀XV04，XV05，XV13，XV16，V08直排。在启动前确认排气过滤器下的阀门XV10关闭与此程序连锁。Media prep. Tank SIP为降低微生物负荷时选用SIP范围为：一路从蒸汽主管道XV14（101图），XV21（103图）至疏水点XV20，V10.另

23、一路蒸汽从XV06，XV07，XV03进罐（102图），排气分两路，一路通过呼吸器到冷凝水点，（初始开XV26排冷空气），另一路通过罐底阀XV04，XV05，XV13， XV16 ，V08至排污管道。WFI Filling罐顶呼吸器开启，打开XV10，XV12进vent管路排气（间歇开冷凝水排点阀门排冷凝水）。通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排出水水温稳定后向罐内注入所要求水量的9095%，打开WFI水点XV02（101）。XV 01，XV02，XV 03。称重方式表示搅拌开启（搅拌与罐内最小量互锁，报警）Solid Material Addition关闭罐顶呼吸

24、器，XV10关闭将称量好的固体物料袋与投料口连接，通过投料口向罐内投料（投料口V04开启与呼吸器互锁），关闭投料口等粉尘完全入水后，打开呼吸器，拆除物料袋Liquid Material Addition通过蠕动泵PU1061向罐内泵入所需要的液体或酸碱，手动调节pH.能边看pH值边开关蠕动泵，设备留蠕动泵电源插座蠕动泵速度可调，泵1，泵2，泵3，共3台泵(分在3台移动式推车上)Mixing设定搅拌速度，搅拌时间，自动搅拌，至物料完全溶解温度，搅拌，重量记录，上传至CCSVolume Fixing通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排，见WFI Filling补充WFI

25、至终体积Sampling取样检测渗透压及其它生化指标 Media Transfer to bagV05阀门后都是软管连接，FL-1061为不锈钢过滤器，带完整性测试口，可单个或2个串联设计开始将media过滤进袋Media称重CIP罐体清洗见1200L Media Prep.应在排污管增加一排污口，供冲洗过滤管路残留液使用。在拆下过滤器前，将过滤管道连接到排污口，用空气将罐内管道内及滤器内的残留液压干，然后再拆下V05及过滤器进行手工清洗。400L Media Prep.Filters installation and integrity test呼吸器气体滤芯FG1062Media初过滤芯（

26、初过滤器旁边预留电源插头，方便移动蠕动泵使用）Tank Rinse Hot WFI Rinse（此时热交换器温控disble）若距离前一次CIP后放置时间不长，则需要Hot WFI Rinse。打开XV01，XV02，XV03通过喷淋球进罐，然后通过底阀XV04，XV05，XV13，XV16，V08直排。Quadro Ytron ZC管路与Tank 及Tank附属管路一起交替RinseTransfer Line hot WFI Rinse （此时热交换器温控disble）传输管的WFI Rinse最好可以选择既能与罐的Tank RinseP同时（组合轮流），又可以独立。运行之前，确定初过滤芯已

27、经取出，确定细胞罐端media过滤芯已经取出来，并且过滤器帽子已经盖好向CCS请求确认细胞罐端的MFILT CIP 开启，确认后再确认transfer panel 连接正确， 1，打开XV 01，XV02， XV09 ，XV26，然后经过transfer panel到300L细胞罐/400LNT，清洗是once through 从细胞罐过滤器drain。通气吹干：从气体滤器FG1064的洁净空气，经WFI热交换器到进罐及管路，注意控制罐的呼吸器的开关控制罐压（见图中黄色路径mark标注）。Media prep. Tank SIP为降低微生物负荷时选用SIP范围为：一路从蒸汽主管道XV14（10

28、1图），XV21（103图）至疏水点XV20，V10.另一路蒸汽从XV06，XV07，XV03进罐（102图），排气分两路，一路通过呼吸器到冷凝水点，（初始开XV26排冷空气），另一路通过罐底阀XV04，XV05，XV13， XV16 ，V08至排污管道。WFI Filling罐顶呼吸器开启，打开XV10，XV12进vent管路排气（间歇开冷凝水排点阀门排冷凝水）。通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排出水水温稳定后向罐内注入所要求水量的2030%（淹没搅拌桨叶），打开WFI水点XV02（101），XV 01，XV02，XV 03。称重方式表示搅拌开启（搅拌与罐内最小

29、量互锁，报警）Solid Material Addition将称量好的固体物料袋与Quadro Ytron ZC 装置吸粉管道相连WFI出水冷却到设定温度用Quadro Ytron ZC步骤1、打开WFI水点XV02（101）。XV 01，XV02，XV 03,WFI注水入罐至淹没搅拌桨（例0.2V,通过sprayball,2、将Quadro Ytron ZC装置进水管6及回流管5与配置罐对应的5和6接口连接，开XV01， XV02， XV09， XV 28后，边加粉边加水，用WFI将粉经均质机冲入罐中（例0.20.5V）通过HM1061。3继续注水将管道内粉水充入罐中（例0.50.95V）通

30、过HM1061 4最后再定容（通过sprayball）400L配制罐与1200L配制罐共用一台移动式Quadro Ytron ZC装置Liquid Material Addition通过蠕动泵PU1062向罐内泵入所需要的液体或酸碱，手动调节pH.能边看pH计值边开关蠕动泵，设备留蠕动泵电源插座。蠕动泵速度可调，泵1，泵2，泵3，共3台泵(分在3台移动式推车上)Mixing设定搅拌速度，搅拌时间自动搅拌，至物料完全溶解温度，搅拌，重量记录，上传至CCSVolume Fixing通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排补充WFI至终体积 Sampling取样检测渗透压及其

31、它生化指标Media Transfer to Bioreactor/NT向CCS确认Media终过滤芯安装完成向CCS确认Media终过滤芯Integrity test完成向CCS确认Media终过滤芯SIP完成向CCS确认选择细胞罐300A，300B，400A,400B向CCS确认transfer panel已正确连接对应的细胞罐/NT media fill Phase已执行通入洁净空气，控制本配制罐罐压，罐压可设置。开启XV15， XV13向罐里通气，通过XV14控制罐压。执行Media Transfer PHASE,将media压入细胞罐中， transfer的培养基重量要求可设置降压M

32、edia Transfer to bag本步骤为选用，有可能配制100l-200L缓冲液在transfer panel 上再增加一路可以接袋子的之路，并且相应的应在排污管增加一排污口，供冲洗过滤管路残留液使用。在拆下过滤器前，将过滤管道连接到排污口，用空气将罐内管道内及滤器内的残留液压干，然后再拆下过滤器进行手工清洗。确认见1.6.11Post-transfer Operation关闭细胞罐进料阀，通过CCS确认。然后在以1.6.11相同的路径Drain excess media; Depress在初过滤housing上手动连接纯化水袋，用PW冲洗transferline，然后drainrem

33、ove cartridges and place blinds at filter housings; 0.2 micron filter integrity test（off-line）配制罐CIP见1200L Media Prep.1200L Media Prep.Filters installation and integrity test呼吸器气体滤芯FG1063Media初过滤芯（初过滤器旁边预留电源插头，方便移动蠕动泵使用）Tank Rinse Hot WFI Rinse（此时热交换器温控disble）若距离前一次CIP后放置时间不长，则需要Hot WFI Rinse。打开XV02

34、， XV05， XV06，XV17通过喷淋球进罐，然后通过底阀XV47，XV49，XV30， XV31,XV34进入排污管路。Quadro Ytron ZC管路与Tank 及Tank附属管路一起交替RinseTransfer Line hot WFI Rinse （此时热交换器温控disble）传输管的WFI Rinse最好可以选择既能与罐的Tank RinseP同时（组合轮流），又可以独立。运行之前，向CCS确定初过滤芯已经取出，细胞罐那边的终端过滤芯已经取出来，并且过滤器帽子已经盖好向CCS请求确认细胞罐端的MFILT CIP 开启，确认后再确认XV43或者XV44开启正确，确认后开XV0

35、2，XV05，XV06，XV16经过软管到Quadro Ytron ZC进口，出口连接到XV28，XV29清洗是once through 从细胞罐过滤器drain通气吹干：从气体滤器FG1064的洁净空气，经WFI热交换器到进罐及管路，注意控制罐的呼吸器的开关控制罐压（见图中黄色路径mark标注）。Media prep. Tank SIP为降低微生物负荷时选用SIP范围为：一路从蒸汽主管道XV14（101图），XV21（103图）至疏水点XV20，V10.另一路蒸汽从XV27，XV07，XV17进罐（101图），排气分两路，一路通过呼吸器到冷凝水点，（初始开XV48排冷空气），另一路通过罐底阀

36、XV47，XV49，XV30， XV31 ，XV 34，V08至排污管道。WFI Filling罐顶呼吸器开启，打开XV20，XV22进vent管路排气（间歇开冷凝水排点阀门排冷凝水）。通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排出水水温稳定后向罐内注入所要求水量的2030%（淹没搅拌桨叶），打开WFI水点XV02（101），XV 05，XV06，XV17。称重方式表示搅拌开启（搅拌与罐内最小量互锁）Solid Material Addition将称量好的固体物料袋与Quadro Ytron ZC 装置吸粉管道相连。WFI出水冷却到设定温度用Quadro Ytron ZC步

37、骤1、打开WFI水点XV02（101）。XV 05，XV06，XV17,WFI注水入罐至淹没搅拌桨（例0.2V,通过sprayball,2、将Quadro Ytron ZC装置进水管9及回流管10与配置罐对应的9和10接口连接，打开XV02， XV05， XV06， XV16，XV50后，开动Quadro Ytron ZC 装置边加粉边加水，用WFI将粉经均质机冲入罐中（例0.20.5V）通过HM1061。3继续注水将管道内粉水充入罐中（例0.50.95V）通过HM1061， 4最后再定容（通过sprayball）与400L配制罐共用一台移动式Quadro Ytron ZC装置Liquid M

38、aterial Addition通过蠕动泵PU1063向罐内泵入所需要的液体或酸碱，手动调节pH. 能边看ph计值边开关蠕动泵，设备留蠕动泵电源插座。蠕动泵速度可调，泵1，泵2，泵3，共3台泵(分在3台移动式推车上)Mixing设定搅拌速度，搅拌时间自动搅拌，至物料完全溶解温度，搅拌，重量记录，上传至CCSVolume Fixing通过热交换器控制WFI出水温度，初始出水水温不稳定的WFI，直排补充WFI至终体积 Sampling取样检测渗透压及其它生化指标 Media Transfer to Bioreactor向CCS确认Media终过滤芯安装完成向CCS确认Media终过滤芯Integr

39、ity test完成向CCS确认Media终过滤芯SIP完成向CCS确认选择的是细胞罐1500A，1500B（XV43和XV44有开关反馈确认信号）对应的细胞罐media fill Phase已执行通入洁净空气，控制本配制罐罐压，罐压可设置。开启XV21， XV20向罐里通气，通过XV22控制罐压。执行Media Transfer PHASE,将media压入细胞罐中，transfer的培养基重量要求可设置降压Post-transfer Operation关闭细胞罐进料阀，通过CCS确认。然后在以1.7.11相同的路径Drain excess media; Depress在初过滤housing

40、上手动连接纯化水袋，用PW冲洗transferline，然后drainremove cartridges and place blinds at filter housings; 0.2 micron filter integrity test off-lineCIPMedia prep. Tank CIP：（请参照路线图1.7.2，但是从CIPS来）配制后进行CIP，所有配制罐底部都有vortex breaker，防止旋窝时气体进入下游工艺管道。CIP程序：1、CIP系统通过罐顶喷淋球清洗，回CIPR，排干；2、清洗液通过CIP清洗，循环3、纯化水循环，排干4、酸液循环，排干5、纯化水循环，

41、排干6、碱液循环，排干7、WFI润洗，回CIPR，排干8、air blowTransfer Line CIP：（请参照路线图1.7.3，但是从CIPS来）运行之前，确定初过滤芯已经取出，细胞罐那边的终端过滤芯已经取出来，并且过滤器帽子已经盖好。向CCS请求确认细胞罐端的MFILT CIP 开启，确认后再确认XV43或者XV44开启正确，确认后开XV02，XV05，XV06，XV16经过软管到Quadro Ytron ZC进口，出口连接到XV28，XV29清洗是once through，以细胞罐端过滤器为高点两边drain Tank Air Blow:罐体是由从呼吸器进的单独一路热air吹到底部

42、后，进排气管路出。而管道的吹干是有CIP系统的空气吹干。Cell Culture 本区域所有设备的状态信息，报警信息，重要参数信息等需要上传到CCS系统Seed recovery复苏：从WCB保藏间取细胞株，用转移桶经物流进接种室，在接种室生物安全柜里进行操作，离心，加培养基，生物安全柜准备，培养：在CO2培养箱里种子复苏培养结束Seed Propagation接种：从T25瓶接种至T75瓶，加培养基培养:在接种室进行细胞扩增培养，T75,摇瓶取样：转移：在生物安全柜里转移至无菌袋。结束10L wave Bioreactor准备：电极校正，补料配制，安装等Media Transfer in：进

43、培养基，初始设定接种:将扩增好的种子细胞接入10L wave bioreactor。Biowelder培养：取样：移种：将种子接种至下一级细胞罐结束60L Bioreactor准备：准备：电极校正，补料配制灭菌以及过滤器完整性检测等SIP：罐体及相应管道在位SIPMedia Transfer in：进培养基，初始设定接种:将扩增好的种子细胞接入10L wave bioreactor。Biowelder培养：取样：移种：将种子接种至下一级细胞罐CIP：利用sartorius配置的CIP系统进行细胞罐在位清洗，加热洁净空气将罐体吹干结束300L Bioreactor准备：电极校正，补料配制灭菌，安

44、装以及过滤器完整性检测等SIP：罐体及相应管道在位SIPMedia Transfer in：进培养基，初始设定接种:将扩增好的种子细胞接入10L wave bioreactor。Biowelder培养：取样：移种：将种子接种至下一级细胞罐CIP：利用sartorius配置的CIP系统进行细胞罐在位清洗，加热洁净空气将罐体吹干结束1500L Bioreactor准备：电极校正，补料配制灭菌，安装以及过滤器完整性检测等SIP：罐体及相应管道在位SIPMedia Transfer in：进培养基，初始设定Nutrient Transfer in：进补料营养液，初始设定接种:将扩增好的种子细胞接入10

45、L wave bioreactor。Biowelder培养：取样：收获：通过罐压将细胞培养液离心至收获罐中。CIP：利用sartorius配置的CIP系统进行1500L细胞罐及400L Nutrient Tank的清洗；洁净空气吹干所有管路，管路选择，时间；加热洁净空气将罐体吹干结束组件清洗补料瓶，桶，电极，软管、microsparger，过滤器housing等组件运至清洗间手工清洗。超声波清洗机组件灭菌在灭菌间灭菌柜灭菌Harverst Centrifuge准备：离心机操作水有压力控制并alarm上传至CCS.用纯化水补水，并用储罐自动补水，开离心机前要保证压力正常，操作水可以自循环。开启离

46、心机至稳定确认：与细胞罐正确连接，安装离心后过滤器，离心机稳定Operation：数据上传Filter安装：将新过滤芯安装到housing中，V05接至离心机纯化水储罐上的PW取样阀，启动PHASE（开启XV25阀门）冲洗至设定时间后，排干。清洗：清洗前从主管路上拆除过滤壳，换上盖帽安装。过滤管路与离心机一起清洗，过滤壳手动清洗，离心机及收获管路清洁准备：按照2.1及2.2准备好收获管路及离心机通过CIP系统用0.5M 热碱液对收获管路及离心机进行循环30min通过CIP系统用室温WFI对收获管路及离心机进行冲洗，直至回流pH值为进口WFI的pH值，排干。停离心机通过CIP系统用空气对收获管路

47、及离心机进行吹干。收获罐SIP蒸汽进口经疏水V01，V09冷凝排点后，分2路进罐，第一路开XV17,XV02，蒸汽从罐顶部喷淋球进罐；第二路开XV18，XV21，XV19。分两路出。第一路为到罐底冷凝排点，第二路经呼吸器到冷凝排点XV43（XV26排冷凝气体）。SIP完后，管路通过热空气进行air blow：开XV09,XV08,热空气从呼吸器进入罐体，XV14，XV44，XV06，XV33，从罐底部冷凝排点XV35排出，设置热空气吹扫时间，将罐内吹干后保压。收获准备：准备好离心机、过滤器、收获罐，选择1500A or 1500B收获，细胞罐加压将细胞液离心进收获罐细胞罐泄压向细胞罐加入100

48、L缓冲液后，重复2.5.2及2.5.3管路排干收获罐CIP用CIP系统将收获罐进行在位CIP,CIP supply从罐顶喷淋球进，从底部排出到CIP return回。完成后，管道用CIP自带的空气吹干。罐体吹干是利用从呼吸器进入空气，罐底疏水排放的路径完成。离心机及收获管道CIP（此即为离心机的CIP）参照2.3收获罐冷却通过向1600Lharvest tank夹套通入乙二醇来给罐内溶液降温，温度，搅拌，重量等参数要上传至CCS.Purification Process DescriptionUF冷注射用水准备将buffer prep tank（VE1211）上pH计进行校准，校准完了，将pH

49、计重新安装到配液罐上。确认罐内无液体后进行重量调零。安装AIR Filter FG（1215），然后进行完整性测试,请CCS确认。AIR Filter FG（1215）SIP，SIP完了以后通入压缩空气，保持管路内正压。安装0.45m的缓冲液过滤器（FL1211）热注射用水冲洗（房间内注射用水总阀是公用系统部分，控制属于工艺），或进行SIP（1）热注射用水冲洗热交换器管路（2）热注射用水冲洗buffer prep tank(VE1211)（3）热注射用水冲洗buffer transfer line安装0.22m缓冲液过滤器（FL1212），安装完毕以后进行完整性测试。CCS请确认TP1215是

50、否切换正确，buffer transfer line开始SIP：从两个过滤器之间进入蒸汽，从buffer hold tank（VE1214）旁路疏水管路排放。buffer hold tank（VE1214）SIPWFI温度调节 往buffer prep tank（VE1211）加入冷注射用水 buffer prep tank加压 缓冲液从buffer prep tank（VE1211）输送到buffer hold tank（VE1214） 泄压 热注射用水冲洗buffer prep tank 热注射用水冲洗buffer transfer line从buffer hold tank（VE1214

51、）旁路排污管路排放。置换液(buffer1)准备CCS确认TP1214切换是否正确。buffer transfer line开始SIP：从两个过滤器之间进入蒸汽，从buffer hold tank（VE1213）旁路疏水管路排放。 buffer hold tank（VE1213）SIP 往buffer prep tank（VE1211）加入80%需要配置缓冲液体积的冷注射用水 称取物料 往配液罐内加料 定容 调节pH 加压 物料转移 泄压 热注射用水冲洗buffer prep tank（VE1211） 热注射用水冲洗buffer transfer line从buffer hold tank（V

52、E1213）旁路排污管路排放。UF系统使用前消毒product transfer line SIP（从收获罐到超滤罐管路SIP）buffer transfer line SIP（从buffer hold tank（VE1214）到UF TANK（VE1121）管路SIPbuffer transfer line SIP（从buffer hold tank（VE1213）到UF TANK（VE1121）管路SIP将0.5N NaOH手动加入到UF TANK(VE1121)中碱液加完以后启动超滤系统，用0.5N NaOH将超滤系统中的保存液（0.1N NaOH）全部顶出。冲顶完毕后，将超滤系统的回流

53、和透过端全部连接到UF TANK(VE1121)中，进行循环30分钟。将罐内和超滤系统中的碱液全部排放完。（罐重量为0时结束）UF TANK（VE1121）CIPbuffer hold tank （VE1214）加压 开启buffer transfer line（从buffer hold tank（VE1214）到UF TANK（VE1121）,往UF TANK（VE1121）中加注射用水。（罐内重量超过300L停止加水，少于150继续加入） 罐内体积超过100L时，开启超滤系统用注射用水清洗，直到排放管路上的电导率仪显示电导符合要求结束清洗。结束后关闭buffer transfer line

54、以及将罐内的注射用水全部排放完。 UFTANK（VE1121）SIPUF 开始操作buffer hold tank （VE1213）加压开启buffer transfer line（从buffer hold tank（VE1213）到UF TANK（VE1121），往UF TANK（VE1121）中加入置换液用罐内置换液将超滤系统中的注射用水顶出。harvest tank（VE1111）加压产品浓缩：开启product transfer line （从harvest tank 到UF TANK），UF TANK（VE1121）开始接受产品。设定超滤入口压力为1.0bar接受范围（0.8bar-

55、1.2bar），回流压力为0.4bar接受范围（0.3-0.5bar）当超滤罐液体超过30L罐搅拌开启，液体超过100L,开启超滤系统将产品进行浓缩。超滤罐内液体超过300L，关闭product transfer line。液体少于150L，重新开启product transfer line。重复开关product transfer line，将harvest tank中的产品全部转移到UF TANK中。 harvest tank产品全部转移完毕（罐内重量为0时转移完毕），harvest tank CIP 缓冲液置换： 开启buffer transfer line（从VE1213到UF TAN

56、K）保持超滤罐内体积在160-180L之间VE1213中置换液剩余约60L 终浓缩将产品浓缩到100L 产品回收将回流阀门全开约用60L置换缓冲液将超滤系统中的产品全部回收到超滤罐内（缓冲液储罐中的置换液全部顶完，产品回收结束） buffer hold tank（VE1213）CIP。 product transfer line CIP（从harvest tank 到超滤罐管路CIP） buffer transfer line CIP(从VE1213到UF TANK)，此处CIP即为热注射用水冲洗。 取样：产品回收到超滤罐内以后，搅拌5分钟取样进行检测。亲和层析层析缓冲液(buffer2)准备

57、 buffer transfer line开始SIP（从VE1211到VE1212管路）： buffer hold tank（VE1212）SIP 往buffer prep tank（VE1211）加入80%需要缓冲液体积的冷注射用水 称取物料 投料 定容 调节pH 加压 物料转移(从VE1211到VE1212)（buffer prep tank（VE1211）罐重量为0时，转移结束） 泄压 热注射用水冲洗buffer prep tank（VE1211） 热注射用水冲洗buffer transfer line从buffer hold tank（VE1213）旁路排污管路排放。层析缓冲液（buf

58、fer 3）准备 将buffer prep tank（VE1221）上pH计仪进行校准 校准完了，将pH计重新安装到配液罐上。确认罐内无液体后进行重量调零。 安装0.45m缓冲液过滤器（FL1221）。 热注射用水冲洗（1）热注射用水冲洗buffer prep tank(VE1221)（2）热注射用水冲洗buffer transfer line（从VE1221到VE1222） 安装0.22m缓冲液过滤器（FL1222），安装完毕以后进行完整性测试。 buffer transfer line开始SIP：从两个过滤器之间进入蒸汽，从buffer hold tank（VE1222）旁路疏水管路排放。

59、 buffer hold tank（VE1222）SIP 往buffer prep tank（VE1221）加入缓冲液配置体积的80%冷注射用水 称取物料 投料 定容 缓冲液pH调节 buffer prep tank加压 物料输送：缓冲液从buffer prep tank（VE1221）输送到buffer hold tank（VE1222）,( buffer prep tank（VE1221）罐重量为0时，转移结束) 泄压 热注射用水冲洗buffer prep tank（VE1221） 热注射用水冲洗buffer transfer line（从VE1221到VE1222，从VE1222旁路排放

60、）层析缓冲液（buffer 4）准备 buffer transfer line开始SIP： 从两个过滤器之间进入蒸汽，从buffer hold tank（VE1223）旁路疏水管路排放。 buffer hold tank（VE1223）SIP 往buffer prep tank（VE1221）加入缓冲液配置体积的80%冷注射用水 称取物料 投料 定容 缓冲液pH调节 buffer prep tank加压 物料输送：缓冲液从buffer prep tank（VE1221）输送到buffer hold tank（VE1223）,( buffer prep tank（VE1221）罐重量为0时，转移