脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析

1、脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析【摘要】建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱，观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法:采用反复冻融法抽提血清蛋白质，以优化的双向电泳技术别离血清蛋白质，建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱，并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进展图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比拟所得目的蛋白质点进展质谱鉴定。结果:通过双向电泳，建立血清蛋白质双向电泳图谱，选取具有明显差异的蛋白点21个进展质谱鉴定，共鉴定出8种蛋白质。结论:通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白

2、表达图谱及质谱分析，可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基矗【关键词】重症肌无力;蛋白质组;电泳;乙酰胆碱受体重症肌无力yastheniagravis，G主要是由乙酰胆碱受体aetylhlinereeptr，AhR抗体介导的，补体参与，细胞免疫依赖性，针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体的自身免疫性疾玻对于G的治疗至今仍缺乏有效手段。蛋白质组技术利用其核心技术双向电泳t-dien-sinalgeleletrphresis，2-DE对组织或细胞总蛋白质进展别离1，并通过正常与疾病组织的差异表达蛋白比拟，找到与该疾病相关的蛋白质分子。本研究通过建立脾肾虚型重症肌无力患者和正常人血清总蛋白

3、质的双向电泳图谱，寻找有明显差异性表达的蛋白，对差异表达的蛋白进展鉴定和研究，为进一步研究G发病机制以及G诊断治疗提供实验基矗1材料与方法1.1血清采集G患者全血来自20222022年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版?中医病证诊断疗效标准?辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期安康志愿者。-70冰箱冷冻保存备用。1.2主要试剂固相pH梯度干胶条IPGstripAersha公司产品，非线性pH310，7。3-3-胆酰胺基丙基二甲氨基丙磺酸盐3-3-hlaidprp

4、yldiethylain-1-prpanesul-fnate，HAPS，二硫苏糖醇DL-dithithrEitl，DTT，三丁基膦tributylphsphine，TBP，尿素，硫脲，碘乙酰胺idaetaide，IAA，丙烯酰胺arylaide、甲双丙烯酰胺N，N-ethylenebi-sarylaide，四甲基乙二胺N，N，N，N-tetra-ethyl-ethylenediaine，TEED，过硫酰胺a-niupersulfate，APS，三羟甲基氨基甲烷trishydrxyethylainethane、甘氨酸glyine，Gly和十二烷基磺酸钠sdiuddeylsulfate，SDS均为

5、Bi-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用illiQ水配制。1.3主要仪器高速冷冻离心机，德国Eppendrf公司产品;EttanTIPGphr，AershaBisi-enes公司产品;P-2000分光光度仪，Hitahi公司产品;SE-600电泳仪，Aersha公司产品;纯水装置，illipre公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bi-Rad公司产品;冷却水循环系统，le-Parer公司产品;Bruker-DaltnisAutFlexTF-TFLIFTassSpetreter，美国Bruker-Daltnis公司产品;LQDeaXPPlus，美

6、国TherFinnigan公司产品。1.4双向电泳1.4.1血清总蛋白质的提取及定量血清-70反复冻融4次后，用AgilentultipleAffinityRe-vallun处理去除高丰度蛋白。使用Agilent5K超滤管进展浓缩除盐，冻干回收的样品，-70保存。用裂解液9l/L尿素、4%HAPS、65l/LDTT和ktail酶抑制剂进展复溶，并采用考马斯亮蓝法进展蛋白质定量。1.4.2等电聚焦自-20取出的胶条，室温下平衡10in，以500g上样量在每份样本中参加上样缓冲液8l/L尿素、2%HAPS、1%Bi-lyte和1%TBP以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，参加矿物油覆盖。程序设置如

7、下:30V12h，500V1h，1000V1h，8000V6h。恒温20。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1Tris-base50l/L、尿素6l/L、甘油30%、SDS2%、溴酚蓝0.002%和DTT100g中于振荡器上振荡15in;然后置入平衡液2成分同平衡液1，用400g碘乙酰胺代替100gDTT同样于振荡器上振荡15in。1.4.3SDS垂直电泳采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶水23.2l，30%丙烯酰胺溶液32.46l，1.5l/LTris-Hl缓冲液pH8.820l，10%SDS0.8l，10%APS0.4l，TEED3.76l，胶总体积80l。将平衡后的IPG胶条移至凝

8、胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽参加电极缓冲液Tris5l/L，Gly192l/L和SDS0.1%。初始电流为每块胶40A，电泳20in，然后以每块胶60A电流，直至溴酚蓝前沿。1.4.4银染色电泳完毕后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景明晰。1.5图像分析每个样品常规进展3次二维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进展扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Iage-aster软件对图像进展背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取Rati1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析

9、均采用SPSS12.0软件，统计学分析采用t检验。1.6基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析用手术刀片切下胶上目的条带，进展切胶、胶上胰蛋白酶酶解20h，抽提酶解肽段，ZipTip脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱atrixassistedlaserdesrptin/inizatintiefflightassspetretry，ALDI-TF-S分析飞行管长2.7，加速电压20kV，反射电压23kV。将第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。1.7数据库检索将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱peptid

10、eassfingerprinting，PF数据于Bi-rksTherFinnigan，SanJse，A软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为IPIhuan蛋白库SEQUEST结果过滤参数为:当harge+1，Xrr1.9;当harge+2，Xrr2.2;当harge+3，Xrr3.75;其中DelN0.1以及NBI上Hsapiens的非冗余蛋白库redundantdata-base。检索参数为胰蛋白酶解;氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸;形式为单同位素峰;肽片断最大误差控制在100pp;肽片断最大分子量误差为0.5Da;每个肽允许有1个不完全裂解位点。2结果2.1脾肾虚型重症肌无力患者血清双向

11、电泳图谱的建立及分析经2-DE技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于一样的条件下重复实验3次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到1463179个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到150889个蛋白点。见图13。2.2差异蛋白质点的鉴定和功能分析通过对2-DE凝胶上差异表达的21个蛋白质斑点进展切割，用胰蛋白酶消化后进展ALDI-TF-S检测。21个点中获得了13张PF图4，另有8个蛋白质点未获得PF。将查询到的结果再结合2-DE图谱上相应蛋白质的分子质量和PI值等进展综合分析，在获得的13张PF数据中有5个无可信搜索结果。在数据库中匹配到符合结果要求的蛋白质有8个。

12、本次检测的8个质点在脾肾虚型重症肌无力患者血清图谱中表达均增加，且差异都具有统计学意义。鉴定的8个质点分别为:载脂蛋白A-I1382号及1438号质点、白蛋白、胎球蛋白B的前体、载脂蛋白E的前体、转甲状腺蛋白前体、泰素耐药相关基因-3和前血清淀粉样蛋白P成分。这些蛋白分布广泛，并具有重要生物学功能。见表1和2。图1正常人血清双向电泳图谱略Figure1T-diensinaleletrphresisapfnralpersnsseru图2脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱略Figure2T-diensinaleletrphresisapfGpatientsseru图3正常人和脾肾虚型重症肌无力

13、患者血清蛋白差异性比拟部分放大图略Figure3AugentedfigurefdifferentiallyexpressedprtEinsparisnbeteenGgrupandnralgrup图4772号样品肽指纹图谱略Figure4PeptideassfingerprintingfSaple772表1通过ALDI-TF-S质谱IPIhuan蛋白库搜索情况列表略Table1DifferentiallyexpressedprteinsbeteenGpatientsandnralpersnsidentifiedby2-DEandALDI-TF-SrESI-SanalysisfIPIhuan表2通

14、过ALDI-TF-S质谱NBI非冗余蛋白库搜索情况列表略Table2DifferentiallyexpressedprteinsbeteenGpatientsandnralpersnsidentifiedby2-DEandALDI-TF-SrESI-SanalysisfNBI3讨论免疫功能调节异常是重症肌无力重要发病机制之一。现已证实，AhR-ab阻滞降解突触后膜受体，使自身抗原主要为烟碱型乙酰胆碱受体活性降低，突触后膜外表积减少，神经-肌肉接头传递障碍，出现肌无力病症，T细胞在该免疫应答过程中起关键作用2，3。90%以上病人血清中可检出AhR-ab4。AhR-ab已成为最重要的G实验室诊断检

15、测指标。该疾病与遗传也有亲密关系。重症肌无力需要长期治疗，且药物毒副作用大5。重症肌无力属中医“瘘证范畴，是以眼睑下垂，四肢软弱无力，晨轻暮重，渐进性加重或伴有吞咽困难、构音不清为特征的疾玻其根本病机是脾肾亏虚。蛋白质组技术包括蛋白别离技术和鉴定技术，也即主要通过2-DE或二维液相色谱分析等蛋白质别离技术，建立蛋白质组图谱，并应用外表增强激光解吸电离或基质辅助的激光解吸离子化质谱技术，并结合飞行时间-质谱系统对结合的蛋白质或多肽进展质谱分析鉴定。双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术68。2-DE技术最大的优势在于它可以对细胞或组织内复杂的蛋白质组分进展整体性分析，从而可以分析不同生理和病理条件

16、下蛋白质组的表达变化。本研究通过双向电泳技术，成功建立了脾肾虚型重症肌无力患者血清2-DE图谱。其中在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上观察到了1463179个蛋白点，而重症肌无力组共观察到150889个蛋白点。PF是对蛋白酶解或降解后所得到的多肽片段质量图谱。对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进展比拟，从而判别所测蛋白是还是未知，并在一定质量误差范围内记录每个蛋白质肽质量理论值与样品蛋白质肽质量测定值相符的数目，理论值与测定值相符数量最多的蛋白质即可能为需鉴定的样品蛋白质。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因此不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。应用肽质指纹数据进展数据

17、库搜索是PF分析蛋白质的最后一步，本研究所鉴定的21个点中共获得了13张肽质量指纹图谱，并在相应数据库中对蛋白进展了检索。本研究初步鉴定的蛋白质点中，在数据库中匹配到符合结果要求的蛋白质有8个。这8个点在重症肌无力患者血清图谱中表达均增加。详细而言，脾肾虚型重症肌无力患者载脂蛋白A-I、载脂蛋白E的前体蛋白、白蛋白、胎球蛋白B的前体、转甲状腺蛋白前体、泰素耐药相关基因-3和前血清淀粉样蛋白P成分均明显高于正常人。这些蛋白大都与物质代谢相关，能促进肌肉淀粉样变。1587号转甲状腺蛋白是含4个一样子单元的四聚体，在单体的情况下可形成淀粉样纤维，造成组织纤维化，并最终导致肌无力及肌萎缩;其主要在人体

18、的肝脏中合成，通常形成致病的类淀粉沉积。其中1401号样品为前血清淀粉样蛋白Ppre-seruaylidP，pre-SAP成分。SAP是一种人类免疫系统的重要蛋白9，广泛存在于淀粉类物质中，被认为与慢性炎症和自身免疫疾病相关。与鉴定的958号样品匹配的为泰素耐药相关基因-3taxlresistantassiatedgene-3，TRAG-3。TRAG-3是Duan等10在寻找泰素耐药基因时发现的一个新的T抗原，其编码的蛋白属于肿瘤/睾丸抗原家族成员。TRAG-3是一个与肿瘤相关的抗原，被作为一个免疫治疗的靶标。有研究发现，TRAG-3细胞毒性T淋巴细胞表位负载树突状细胞疫苗在体外可以有效激发抗

19、瘤细胞毒性T淋巴细胞的免疫反响11。本研究提示，这些基因或蛋白质还可能与重症肌无力发病的免疫机制相关，但尚待进一步验证。重症肌无力是一与免疫相关的疾病，其发病的详细分子机制尚不十清楚确。本研究通过双向电泳及质谱分析技术，对照正常组，鉴定了8个差异表达蛋白，这为进一步研究该疾病的分子机制提供了基矗4致谢感谢龙华医院科研实验室及中国科学院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心。【参考文献】1HanashS.Diseaseprteis.Nature.2022;4226928:226-232.2LanRY，AnsariAA，LianZX，etal.RegulatryTells:develpent，funt

20、inandrleinautiunity.AutiunRev.2022;46:351-363.3InadaK，kuura，ShinH，etal.Rlefpsitiveseletinfthya-assiatedTellsinthepathgenesisfyastheniagravis.JSurgRes.2022;1261:34-40.4daK，ShibasakiH.yastheniagravis:antibdiestextraellularlyexpsedantigenideterinantsfaetyl-hlinereeptr.Neurlgy.1986;3610:1374-1377.5SiebJP.yastheniagravis:eergingnetherapyp-tins.urrpinPharal.2022;53:303-307.6asingerV，rdellSJ，erpa-PljakA，eta1.Pr-gressithgene-prdutappingfthelliutes:y-plasagitaliu.Eletrphresis.1995;167:1090-1094.7PetriinEF，ZnK，KhnE，etal.linialpr-tei