氨基酸发酵工艺学

1、氨基酸发酵工艺学第一节 学习氨基酸发酵工艺学的目的研究对象、任务及内容 氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,由发酵所生成的产物氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢,使有用产物大量生成、积累。 以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸发酵生产以发酵为主,发酵的好坏是整个生产的关键,但后处理提纯操作和提纯设备选用当否,也会大大影响总的得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终产品获得的整个过程,其中有微生物生化问题、生化工程问题,也有分析与设备问题。 今后的发展是采用诱变、细胞工程、基

2、因工程的手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种,提高产酸;采用过程控制,进行最优化控制,连续化、自动化,稳产、高产;探求新工艺、新设备,以提高产率和收得率;研究发酵机制等问题,以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。 第二章 谷氨酸发酵机制 第一节 谷氨酸的生物合成途径一、生成谷氨酸的主要酶反应 (1)谷氨酸脱氢酶(GHD)所催化的还原氨基化反应 (2)转氨酶(AT)催化的转氨反应 (3)谷氨酸合成酶(GS)催化的反应二、谷氨酸生物合成的理想途径 由葡萄糖发酵生成谷氨酸的理想途径如下 谷氨酸发酵的代谢途径如下图所示黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制如下图所示优先合

3、成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈阻遏和反馈抑制。柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制。 异柠檬酸脱氢酶的调节 细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当-酮戊二酸过量时,将对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用,停止合成-酮戊二酸。 -酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸产生菌中先天性的丧失或微弱。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。三、谷氨酸生产菌的育种思路 谷氨酸生产菌的具体育种思路 1.切断或减

4、弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢 6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株 1.切断或减弱支路代谢 选育减弱-酮戊二酸进一步氧化能力的突变株 从谷氨酸生物合成的代谢途径可以看出，减弱-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。 如果削弱或切断这些物质的合成途径，就会使谷氨酸的产率增加。这可通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素，如德夸菌素、狭霉素C抗性突变株来实现。选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株 在谷氨酸生物合成途径中，从葡萄糖到丙酮酸的反

5、应是由EMP途径和HMP途径组成的。但是，通过HMP途径也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、辅酶Q、维生素K、叶酸等物质。这些物质的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低选育不分解利用谷氨酸的突变株 为了积累谷氨酸，就必须使菌种不能分解利用谷氨酸，这可通过选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变株来实现。选育减弱乙醛酸循环的突变株 四碳二羧酸是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的。减弱乙醛酸循环，CO2固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高。这可通过选育琥珀酸敏感型突变株、不分解利用乙酸突变株、异柠檬酸裂解酶活力降低菌株来实现。阻止谷氨酸进一步代谢 由于细胞还可以谷氨酸为前

6、体继续向下合成谷氨酰胺等，就必然会导致谷氨酸的积累量减少，为此要避免谷氨酸被菌体利用，还需要切断谷氨酸向下的代谢途径。2.解除菌体自身的反馈调节 选育耐高渗透压突变株 要使菌种能高产谷氨酸,首先要使菌种具备在高糖、高谷氨酸的培养基中仍能正常生长、代谢的能力 即在高渗培养基中菌体的生长和谷氨酸的合成不受影响或影响很小。这可通过选育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷氨酸突变株来实现。选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 当谷氨酸合成达到一定量时，谷氨酸就会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶，使谷氨酸的合成停止，使代谢转向天冬氨酸的合成。若解除了谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈调节，菌体就会不断的合成谷氨酸

7、。这可通过选育酮基丙二酸抗性、谷氨酸结构类似物抗性（如谷氨酸氧肟酸盐）、谷氨酰性突变株来实现。3、增加前体物的合成 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株 这可通过选育柠檬酸合成酶活力强突变株及抗氟乙酸、氟化钠重氮丝氨酸、氟柠檬酸等突变株来实现。选育强化CO2固定反应的突变株 这可通过选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源生长良好的突变株、氟丙酮酸敏感突变株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突变株来实现。4.提高细胞膜的渗透性 选育抗Vp类衍生物突变株 选育抗Vp类衍生物，如香豆素、卢丁等突变株，都能遗传性的改变细胞膜的渗透性。 选育溶菌酶敏感突变株。 选育二氨基庚二酸缺陷突变株。选育温度敏感突变

8、株 谷氨酸温度敏感突变株的突变位置是在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为该基因所指导的酶，在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。 当控制培养温度为最适生长温度时，菌体正常生长；当温度提高到一定程度时，菌体便停止生长而大量产酸。5、强化能量代谢 谷氨酸高产菌的两个显著特点是:-酮戊二酸继续向下氧化的能力微弱和乙醛酸循环微弱，使能量代谢受阻，TCA循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢可弥补上述两点不足，使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快。选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变

9、株来实现。选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。3选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。 四、谷氨酸发酵的代谢途径 在谷氨酸发酵时,糖酵解经过EMP及HMP两个途径进行,生物素充足菌HMP所占比例是38%,控制生物素亚适量的结果,发酵产酸期,EMP所占的比例更大,HMP所占比例约为26%。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径中的主要过程至少有16步酶促反应。 在糖质原料发酵法生产谷氨酸时,应尽量控制通过CO2固定反应供给四碳二羧酸;在谷氨酸发酵的菌体生长期,需要异柠檬酸裂解酶反应,走乙醛酸循环途径。菌

10、体生长期之后,进入谷氨酸生成期,最好没有异柠檬酸裂解酶反应,封闭乙醛酸循环。 在生长之后,理想的发酵按如下反应进行: C6H12O6+NH3+1.5O2 C6H9O4N+CO2+3H2O 理论收率为81.7%。四碳二羧酸是100%通过CO2固定反应供给。若通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸,则理论收率仅为54.4%,实际收率处于中间值。 第二节 谷氨酸生物合成的调节机制 一、优先合成与反馈调节 二、糖代谢的调节 三、氮代谢的调节 四、其它调节 关于糖代谢的调节，主要包括： 能荷控制：糖代谢的调节主要受能荷的控制，即受细胞内能量水平的控制。当生物体内生物合成或其他需能反应加强时，细胞内ATP分解，生成

11、ADP和AMP，能荷降低。低能荷会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制，并抑制糖原合成的酶(如糖原合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等)，从而加速糖酵解，使TCA循环产生能量，通过磷酸化作用生成ATP。 当细胞内能荷高时，ATP增加，抑制糖原降解、糖酵解和TCA循环的关键酶，如糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸合成酶，并激活糖类合成所需要的酶，如糖原合成酶和果糖-1，6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分解，加速糖原的合成。生物素的影响： 生物素对糖代谢的影响，主要是影响糖降解速度，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高

12、，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出。 生物素对CO2固定反应也有影响研究表明，生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应。据有关资料报道,当生物素大过量（100g/L以上）时，CO2固定反应可提高30%。 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸的阻遏，为醋酸所诱导。 以葡萄糖为原料发酵生成谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。因为丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速率减慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少。另外，该酶受琥珀酸阻遏，生物素亚适量时因琥珀酸氧化能力降低而

13、积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动。 关于氮代谢的调节，众所周知，控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。 在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成

14、增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。 第三节 谷氨酸发酵中如何控制 细胞膜的渗透性一、控制细胞膜渗透性的方法 .化学控制方法 2.物理控制方法 二、强制发酵控制工艺 详见教材P99-100 第三章 谷氨酸生产菌的特征、 育种及扩大培养 第一节 谷氨酸生产菌的 主要特征与菌学性质 现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。 1.棒状杆菌属(Corynebacterium) 2.短杆菌属(Brevibacterium) 3.小杆菌属(Microbacterium) 4.节杆菌属(Arthrobacterium) 第二节 国内谷氨酸生产菌及

15、其比较一、北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征二、钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征 三、天津短杆菌(T6-13)的形态和生理特征 四、北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较 五、天津短杆菌(T6-13)与钝齿杆菌(B9)的比较 六、目前味精行业采用的主要菌株 S9114 华南理工大学 FD415 上海复旦大学 TG961 天津科技大学第三节 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化一、种子的菌体形态 斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下,细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝

16、;细胞排列呈单个、成对及V字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态 从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态.三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态 发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖缺乏字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。 在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有

17、细胞碎片 。 第四节 谷氨酸发酵的代谢控制育种一、日常菌种工作 二、选育耐高渗透压菌种 三、选育不分解利用谷氨酸的突变株 四、选育细胞膜渗透性好的突变株 五、选育强化CO2固定反应的突变株 六、选育减弱乙醛酸循环的突变株七、选育强化三羧酸循环中从柠檬 酸到-酮戊二酸代谢的突变株 八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢 酶反馈调节的突变株 九、强化能量代谢十、选育减弱HMP途径后段酶活性的 突变株 第五节 应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌一、应用原生质体融合新技术选育 谷氨酸生产菌二、应用转化法选育谷氨酸生产菌三、应用转导法选育谷氨酸生产菌四、应用重组DNA技术构建谷氨酸工 程菌五、应用固定化细胞技术

18、发酵生产谷氨 酸 第六节 菌种的扩大培养和种子的质量要求 种子培养过程斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐 第四章 谷氨酸发酵控制 第一节 发酵培养基一、碳源 目前所发现的谷氨酸产生菌均不能利用淀粉,只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等,有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃等作碳源。二、氮源 无机氮源: (1)尿素 (2)液氮 (3)碳酸氢铵 有机氮源:主要是蛋白质、胨、氨基酸等。谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液和糖蜜等。三、无机盐 (1) 磷酸盐 (2) 硫酸镁 (3) 钾盐 (4) 微量元素四、生长因子 (1) 生物素 (2) 维生素B1 第二节 温度对谷氨酸发

19、酵的影响 温度对谷氨酸发酵的影响是多方面的。从酶反应动力学来看,温度升高,反应速度加快,产物生成速度提前。酶是蛋白质，受热容易失活温度愈高失活愈快,菌体易衰老,影响发酵液的性质来间接影响发酵,影响基质和氧的溶解从而影响发酵。温度影响细胞中酶的活性,而影响代谢途径方向。 各种微生物在一定条件下,都有一个最适的生长温度范围。谷氨酸产生菌的最适生长温度为3040,产生谷氨酸的最适为3537。若温度过高,菌体容易衰老。生产上表现为OD值增长慢,pH值高,耗糖慢,发酵周期长,谷氨酸生成少。 应及时降温,采用小通风,流加尿素以少量多次;必要是时可补加玉米浆,以促进生长。适当提高温度可加快发酵速率。第三节

20、pH值对谷氨酸发酵的影响 一、 pH值对谷氨酸发酵的影响详见教材P108二、发酵过程pH 值的变化及控制 详见教材P108 第四节 供氧对谷氨酸发酵的影响 一、溶解氧与谷氨酸的需氧量二、供氧对谷氨酸发酵的影响三、供氧与其他发酵工艺条件的关 系四、氧对发酵影响的微生物生理学 察 第五节 泡沫的消除一、泡沫对发酵的影响二、泡沫的形成和性质三、发酵过程泡沫形成的规律四、泡沫的消除 第六节 发酵过程主要变化及 中间代谢控制1.适应期2.对数期3.转化期4.产酸期谷氨酸的发酵过程曲线 第七节 异常发酵现象及其处理 详见教材P114 第八节 发展方向1、一次高浓度糖发酵2、降低发酵初糖浓度,连续流加糖发酵

21、3、混合碳源发酵4、应用电子计算机控制和管理发酵,使发酵工艺最佳化5、固定化活细胞连续发酵生产谷氨酸第六章 谷氨酸的提取 第一节 概 述 将谷氨酸生产菌在发酵液中积累的L-谷氨酸提取出来,再进一步中和、除铁、脱色、加工精制成谷氨酸单钠盐叫提炼。 谷氨酸是发酵的目的物,它溶解在发酵液中,而在发酵液中还存在菌体、残糖、色素、胶体物质以及其他发酵副产物。 提取工艺的选择原则:工艺简单,操作方便,提取收率高,产品纯度高,劳动强度小,设备简单,造价低,使用的原材料、药品价廉,来源容易。 主要提取方法简介1、等电点法 2、离子交换法3、等电-离交法 4、连续等电点法5、金属盐法 6、盐酸水解-等电点法 7

22、、离子交换膜电渗析法提取谷氨酸等电点法提取谷氨酸的原理 等电点法是谷氨酸提取方法中最简单的一种方法,由于设备简单、操作简便、投资少等优点,谷氨酸发酵液不经除菌或除菌、不经浓缩或浓缩处理、在常温或低温下加盐酸调至谷氨酸的等电点pH3.22,使谷氨酸呈过饱和状态结晶析出。谷氨酸分子中含有2个酸性的羧基和一个碱性的氨基,在不同的pH值溶液中以GA+、GA 、GA-、GA、表示。 pH 为3.22时,大部分谷氨酸以GA形式存在,此时谷氨酸的氨基和羧基的离解程度相等,总静电荷为零。谷氨酸的等电点习惯上常以pI代表。总静电荷等于零,由于谷氨酸分子之间的相互碰撞,并通过静电引力的作用,会结合成较大的聚合题体而沉淀析出。因而在等电点时,谷氨酸的溶解度最小。 pH对谷氨酸溶解度的影响 谷氨酸的溶解度随PH值的改变而改变, pH 3.22和在30%以上的高浓度盐酸下,溶解度便显著减少到最低点。 温度对谷氨酸溶解度的影响 谷氨酸溶解度受温度的影响较大,温度越低,溶解度越小。 第三节等电点法提取谷氨酸 二、谷氨酸的结晶（1）谷氨酸的晶型及其性质 （