大学生物化学之蛋白质市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、蛋白质概述一、蛋白质化学组成与分类二、蛋白质形状、大小和分子量三、蛋白质功效多样性第1页蛋白质化学组成与分类1.元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少许硫。一些蛋白质还含有其它一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中组成百分比约为： 碳 50-55% 氢 6.5-7.3 氧 19-24 氮 16% 硫 0-3 其它 微 量第2页蛋白质含氮量大多数蛋白质含氮量靠近于16%，这是蛋白质元素组成一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量计算基础。所以，能够依据生物样品中含氮量来计算蛋白质大约含量：样品中蛋白质含量=蛋白氮 6.256.2

2、5为蛋白质系数，即1克氮所代表蛋白质量（克数）第3页蛋白质分类一、按化学组成份1、单纯蛋白：只含蛋白成份2、缀合蛋白：蛋白+辅基第4页单纯蛋白单纯蛋白只含由-氨基酸组成肽链，不含其它成份。1，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。第5页由单纯蛋

3、白与其它非蛋白成份结合而成。1、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。2、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中糖蛋白等。3、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。4、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中核糖核蛋白等。缀合蛋白第6页蛋白质分子组成： 经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为-氨基酸：不变部分可变部分第7页蛋白质形状、大小与分子量蛋白质是分子量很大生物分子。对任一个给定蛋白质来说，它全部分子在氨基酸组成和次序以及肽链长度方面都应该是相同，即所谓均一蛋白质。

4、第8页按形状和溶解度可将蛋白质分为：1、纤维蛋白2、球状蛋白3、膜蛋白按肽链组成份1、单体蛋白 2、寡聚蛋白或多聚蛋白第9页蛋白质分子量改变范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。一些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)经过非共价结合而成，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质分子量可高达数百万甚至数千万。（TMV：4x107）第10页1 D = 1.66033 10-27 Kg对于只含有多肽链简单蛋白质：氨基酸残基数目=蛋白质分子量 / 110 （氨基酸残基平均分子量 110）John Dalton第11页三、蛋白质功效多样性催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效

5、催化代谢反应。这是蛋白质一个最主要生物学功效第12页 调整蛋白参加基因表示调控。它们激活或抑制遗传信息转录为RNA激素参加代谢调整催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效调整基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白（有活性）基 因 关 闭开启子OR第13页催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效受体蛋白起接收和传递信息作用。第14页催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效 一些蛋白质含有转运功效，携带各种小分子、离子等从一处到另一处。第15页有些蛋白质有贮藏氨基酸作用，用作有机体生长发育氮源。如蛋类中卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮素小麦种子中醇溶蛋白

6、为种子发芽提供氮素。催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效第16页催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效人和动物运动，靠肌肉收缩来实现，参加肌肉收缩主要成份是肌球和肌动蛋白，没有肌球蛋白和肌动蛋白，就没有些人和动物运动。第17页 构建和维持生物体结构，这类蛋白称为结构蛋白。细胞片层结构，如细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜和内质网膜等都是由不溶性蛋白与脂类组成。在高等动物里，胶原蛋白参加结缔组织和骨骼形成，作为身体支架。 动物毛发和指甲都是由角蛋白组成。催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效第18页有些蛋白质含有主动防护功效，抵抗外界不利原因对生物体干扰。如脊椎动物体内免疫球蛋

7、白（抗体），能中和外来有害物质（抗原）。抗冻蛋白：南极水域中一些鱼类血液中含有，保护血液不被冻凝。蛇毒和蜂毒溶血蛋白和神经毒蛋白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等少许可引发高等动物产生强烈毒性反应。催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效第19页应乐果甜蛋白有着极高甜度，作甜味剂。一些海洋生物如贝类，分泌一类胶质蛋白，能将贝壳牢靠地粘在岩石或其它硬表面上催化调整受体转运贮存运动结组成份 防御异常功效第20页总而言之：蛋白质存在于全部生物细胞中，是组成生物体最基本结构物质和功效物质。 蛋白质是生命活动物质基础，它参加了几乎全部生命活动过程。第21页蛋白质分子结构一、蛋白质一级结构二、蛋白质二

8、级结构和纤维状蛋白三、蛋白质三级结构四、蛋白质四级结构第22页 蛋白质结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成生物大分子。蛋白质与多肽并无严格界限，通常是将分子量在6000道尔顿以上多肽称为蛋白质。第23页蛋白质一级结构1. 定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 要求：蛋白质一级结构指蛋白质多肽连中AA排列次序，包含二硫键位置。其中最主要是多肽链氨基酸次序，它是蛋白质生物功效基础。第24页胰岛素（insulin ）一级结构：胰岛素分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间

9、由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位2个Cys残基之间形成一个链内二硫键。胰岛素是动物胰脏细胞分泌一个分子量较小激素蛋白，主要功效是降低体内血糖含量。第25页 肽（peptide）一个氨基酸羧基与另一个氨基酸氨基之间失水形成酰胺键称为肽键，所形成化合物称为肽。一、肽与肽键由两个氨基酸组成肽称为二肽，由多个氨基酸组成肽则称为多肽。组成多肽氨基酸单元称为氨基酸残基。第26页 肽键（peptide bond）： 0.127nm键长=0.132nm 0.148nm肽平面：组成肽键四个原子（C、O、N、H）和与之相连两个碳原子都处于同一个平面内，此刚性结构平面称肽

10、平面或酰氨平面。肽键特点是氮原子上孤对电子与羰基含有显著共轭作用。肽键中C-N键含有部分双键性质，不能自由旋转。第27页肽键肽键中C-N键含有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。第28页在多肽链中，氨基酸残基按一定次序排列，这种排列次序称为氨基酸次序通常在多肽链一端含有一个游离-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸次序是从N-端氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点排列次序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln二、肽链中AA排列次序和命名第29页 从肽链N-末端开始，残基用酰称呼。 比如：丝氨酰甘氨酰

11、酪氨酰丙氨酰亮氨酸, 简写：Ser-Gly-Tyr - Ala - Leu， 书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA残基放在右边。 共价主链：肽链骨干是由-N -C -C -序列重复排列而成，称为共价主链。肽命名第30页四肽结构第31页三、肽主要理化性质1.每种肽也有其晶体，晶体熔点都很高。2.在pH0-14范围内，肽酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离基团。3.每一个肽都有其对应等电点，计算方法与AA一致且复杂。 B2+B+BB-B2-K1K2K3K4pI=pK2+ pK3/2第32页4. 肽化学反应：也能发生茚三酮反应、 Sanger反应

12、、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应。第33页双缩脲反应含有两个以上肽键多肽，含有与双缩脲相同结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定主要反应。红紫色络合物(硷性溶液)Cu2+双缩脲是两分子尿素经加热失去一分子NH3而得到产物肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有颜色反应第34页四、 天然存在主要多肽在生物体中，多肽最主要存在形式是作为蛋白质亚单位。不过，也有许多分子量比较小多肽以游离状态存在。这类多肽通常都含有特殊生理功效，常称为活性肽（active peptide）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。第35页与真核生物RNA聚合

13、酶和牢靠结合第36页 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽第37页 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。 能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病症。 第38页 CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CHNH2C

14、OOHCH2SH谷胱甘肽存在与动、植物及微生物中： 1.参加体内氧化还原反应 2.作为辅酶参加氧化还原反应 保护巯基酶或含Cys蛋白质中 SH还原性,预防氧化物积累2GSHGS-SG第39页 2.蛋白质一级结构测定蛋白质氨基酸次序测定是蛋白质化学研究基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素一级结构以来，现在已经有上千种不一样蛋白质一级结构被测定。 第40页测定蛋白质氨基酸次序主要意义：测定蛋白质中AA次序，是走向说明其生物功效基础中很主要步骤。次序能够给出更多信息。为了了解多肽链折叠成三维构象所受到限制，次序测定是必须。AA次序改变能够造成异常功效和疾病，所以次序测定是分子病理学一个主

15、要部分。蛋白质中AA次序很能指明它进化史。 第41页a、样品必需纯（97%以上）；b、知道蛋白质分子量；能够预测AA数目，工作量大小。c、知道蛋白质由几个亚基组成；（1）测定蛋白质一级结构要求第42页 (2) 测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链数目和种类。 经过测定末端氨基酸残基摩尔数与蛋白质分子量之间关系，即可确定多肽链数目。蛋白质一级结构测定第43页B.多肽链拆分。 由多条多肽链组成蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋白质一级结构测定第44页B.多肽链拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即

16、可分开多肽链(亚基).尿素和盐酸胍与蛋白质可能作用方式：a.与肽链竞争氢键b.增加非极性侧链在 水中溶解度蛋白质一级结构测定（NH）脲或胍第45页C.二硫键断裂 几条多肽链经过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成巯基，以预防它重新被氧化。蛋白质一级结构测定SH-CH2-CH2-OH第46页能够经过加入盐酸胍方法解离多肽链之间非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间二硫键。蛋白质一级结构测定ssHcoooHSO3HSO3H第47页SSSSSS胰岛素HO-CH2-CH2-SH

17、SHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOH还原保护第48页 D.分析多肽链N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸次序分析中，最主要是N-端氨基酸分析法。蛋白质一级结构测定第49页N-端氨基酸分析：Sanger反应、Edman反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。C-端氨基酸分析：第50页又称Sanger法。2,4-二硝基氟苯与肽链N-端游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-蛋白质）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。

18、该产物能够用乙醚抽提分离。不一样DNP-氨基酸能够用色谱法进行判定。N-末端基氨基酸测定（1）二硝基氟苯（DNFB）法第51页丹磺酰氯（DNS）与N-端氨基酸游离氨基作用，得到DNS-蛋白质，水解得DNS氨基酸。此法优点是DNS-氨基酸有很强荧光性质，不需提取可直接检测，检测灵敏度高。N-末端基氨基酸测定（2）丹磺酰氯法第52页（3） PITC法（ Edman 法）N-末端基氨基酸测定第53页第54页氨肽酶是一个肽链外切酶，它能从多肽链N-端逐一向里水解。依据不一样反应时间测出酶水解所释放出氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质N-末端残基次序。最惯用氨肽酶

19、是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端肽键速度最大。N-末端基氨基酸测定（4）氨肽酶法第55页此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水物质而与C-端氨基酸分离。肼解法第56页还原法肽链 C末端氨基酸可用硼氢化锂还原成对应氨基醇，再用层析法加以判定。Sanger早期就是采取这个方法判定胰岛素A、B链C末端氨基酸第57页羧肽酶是一个肽链外切酶，它能从多肽链C-端逐一水解AA。依据不一样反应时间测出酶水解所释放出氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质C-末端残基次序。当前惯用羧肽酶有四种：A,B,

20、C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外全部C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基肽键。羧肽酶(carboxypeptidase)法第58页E.多肽链断裂成多个肽段，可采取两种或各种不一样断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽链断裂法：酶解法和化学法第59页 酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等第60页Trypsin ：R1=Lys和Arg时（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。水解位点胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2第61页或胰凝乳蛋白

21、酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。肽链水解位点糜蛋白酶第62页Pepsin：R1和R2Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro 水解受抑。肽链水解位点胃蛋白酶第63页thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶第64页谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu (磷酸

22、缓冲液或醋酸缓冲液)精氨酸蛋白酶： R1=Arg肽链水解位点谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶（R1=Arg,GlyAlaLeuGluAsp）和弹性蛋白酶(R1=AlaValGlySer)第65页 化学法：可取得较大肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸羧基所形成肽键。第66页 羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间肽键以及-Asn-Ala-之间肽键。第67页F.分离肽段测定每个肽段氨基酸次序。蛋白质一级结构测定第68页 测定每条多肽链氨基酸组成Edman反应第69页2、氨肽酶法或羧肽酶法3、质谱法（MS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快第70页第71页第72页第73页第74页核糖体蛋白质链4.依据核苷酸序列推定法第75页G.确定肽段在多肽链中次序。 利用两套或多套肽段氨基酸次序彼此间交织重合，拼凑出整条多肽链氨基酸次序。第76页H.确定原多肽链中二硫键位置。采取胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定第77页普通采取胃蛋白酶处理含有二硫键多肽链(切点多；酸性环境下预防二硫键发生交换)。将所得肽段利用Brown及Hartlay对角线电泳技术进行分离。第78页+-+-第二向第一向Brown和Hartlay对角线电泳图解pH6.5