核酸检测试剂性能验证及质检（新冠肺炎核酸检测学习专家课堂）

1、核酸检测试剂性能验证及质检CNAS-CL02：2012医学实验室质量和能力认可准则CNAS-CL02-A009医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明 CNAS-GL039:2019 分子诊断检验程序性能验证指南感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国卫办医函20171190号）GBT22576-2008医学实验室-质量和能力的专用要求2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点GBT37875-2019 核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范GBT37875-2019 YY/T 17172020 核酸提取试剂盒（磁珠法）临床分子生物学检验技术要求2019，人民卫生出版社主要参

2、考文件资料性能验证的概念一性能验证：特指使用某种检测方法的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使 用时能复现生产厂家所宣称的检测性能。（CLIA uses the term “verification”： specifically to relate to confirmation that the laboratory using a test can replicate the manufacturers performance claims when the test is used according to the package insert）性能验证是指为确保实验室开展的检验项

3、目、所应用的检测系统的分析性能或检验项 目的方法学能够满足检测及临床要求，从而保证患者标本检测结果准确可靠所进行的 一些列验证试验。性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW某实验室广东省第二次新冠病毒核酸室间质评检测结果提取试剂相同，扩增试剂不同提取试剂不同，扩增试剂相同20200201ORF1A/B(CT值)26.2826.8531.66N基因(CT值)29.9723.1527.5920200202ORF1A/B(CT值)34.2635.6537.91N基因(CT值)33.6424.7432.9820200203ORF1A/B(CT值)38.4135.339.77N基

4、因(CT值)22.5626.2633.5620200204ORF1A/B(CT值)44.4236.6140.85N基因(CT值)33.8126.435.4420200205ORF1A/B(CT值)37.5738.3238.52N基因(CT值)33.1127.8337.58性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW检验前检验中检验后质量保障是永恒的主题人员 场地 设备 试剂 耗材性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW检验程序常规应用前任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后，应在检测系统重新启用前对受影 响的性能进行部分性能验证启用新的检测系统或现

5、用检测任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更，如试剂 升级/更换、仪器更新、校准品溯源性改变等应按照新系统进行验证常规使用期间，可利用日常工作的检验和质控数据，定期对检验程序的分析性能 和分析系统的稳定性进行评估性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW按照实验室管理办法和认可准则的要求，医疗机构临 床实验室应承担所开展检验项目的性能验证工作项目的性能评估必须在进行临床检测的地点进行性能验证的5W1H二WHYWHENWHEREWHOWHATHOW5.5.1.2 检验程序验证在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程 序进行独立验证。实验室应从制造商或方法开发者

6、处获得相关信息， 以确定检验 程序的性能特征。实验室进行的独立验证，应通过获取客观证据（以性能特征形 式）证实检验程序的性能与其声明相符。验证过程证实的检验程序的 性能指标，应与检验结果的预期用途相关。实验室应将验证程序文件化，并记录验证结果。验证结果应由适 当的授权人员审核并记录审核过程。性能验证的5W1H二WHYWHENWHEREWHOWHATHOW性能验证的5W1H二WHYWHENWHEREWHOWHATHOWPCR定性检验程序性能验证参数PCR定量检验程序性能参数方法符合率/正确度测量正确度重复性测量精密度检出限检出限和定量限抗干扰能力&交叉反应分析特异性线性区间及可报告区间性能验证的

7、判断标准厂商或研发者在试剂盒或检 测系统说明书中声明的性能 指标性能验证的5W1H二WHYWHENWHEREWHOWHATHOW实验前准备（CNAS-GL039:2019）操作人员应熟悉检验方法的原理与操作实验室设施及环境符合分析系统工作要求仪器经过校准，各项性能指标合格试剂和校准品满足要求负责实施性能验证的人员制定验证计划（特别是各项性能参数的判断标准的制定 及其依据）若涉及核酸提取，应使用试剂盒配套或推荐的核酸提取试剂，并确保提取效率满 足要求性能验证的5W1H二WHYWHENWHEREWHOWHATHOW性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW正确度/符合率验证方

8、法 (确定方法学)通过与参比方法进行比较（金标准、行业公认方法、经性能验证符合要求满足临 床预期用途的方法（如：通过ISO15189认可实验室使用的相同检测方法）参加国家/省临检中心室间质评：最为常用。检测卫生部临检中心质评物，检测 结果均在允许范围内。采用参考材料：厂商/第三方提供的参考物质典型的CoV的基因组包含6-11个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）。第一个ORF（ORF1a和ORF1b）约占整个基因 组长度的三分之二，主要负责编码病毒RNA 聚合酶复合蛋白pp1ab其他ORF编码至少四个主要结构蛋白（S、E、M和N蛋白）临床实验室对病毒RNA进行检测的技术主

9、要 分两种：实时荧光RT-PCR以及病原宏基因组 测序（mNGS）新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW正确度/符合率性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW正确度/符合率候选方法参比方法总数+-+ABA+B-CDC+D合计A+CB+DA+B+C+D验证方案选取阴性样品至少5份、阳性样品至少10份（阳性样本中应包括弱阳性和强阳性样品。 若弱阳性样品不好获取，可用适当基质稀释强阳性样品获得类似的效果阳性符合率=A/(A+C)*100%阴性符合率=B/(B+D)*100%总符合率=A+D/(A+B+C+D)*1

10、00%定性检验程序验证方案：选择2个样本，1个阴性，1个弱阳性样本，每天检测一次，20天完成检测判断标准：结果一致性，符合率90%. 注意事项：定性项目精密度评价时样品应选择接近临界值水平的样本。每次试验均应设立阴阳性质控，质控在控为实验数据有效 的前提。二性能验证的5W1HWHYWHOWHENWHATWHEREHOW重复性（精密度）定量检验程序验证批内精密度和批间精密度标本选择：选择低、中、高三个浓度或中、高两个浓度的新鲜标本/质控品；试验方法：连续重复测定20次（定性同批，定量每天1次测试，连续测试20天； 或每天4次测试，连续测定5天）；结果计算：计算后20次检测结果的SD和CV；判断标

11、准：以能力验证/室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），批内精密 度1/4TEa，批间精密度1/3TEa，或者符合试剂说明书的要求。注意事项：批间精密度时应考虑检测物的稳定性，若检测物不稳定，可使用质 控品进行该试验二性能验证的5W1HWHYWHOWHENWHATWHEREHOW重复性（精密度）标准偏差SD平均值X变异系数CV样本10.151.845.19%样本20.057.420.67%二性能验证的5W1HWHYWHOWHENWHATWHEREHOW检出下限CNAS-GL039:2019验证要求：当所用检验程序在厂家试剂使用说明书等有声明检出限时，检测项目在有标准物质时，或以 定量形式表达

12、定性结果时，应进行检出限的验证。验证方案样本：定值标准物质（国际参考品、国家参考品、厂家参考品）方法：将定值标准物质梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，重复测定5次或在不同批内对该浓度样品进 行20次重复测定（如测定5天，每天测定4份样本）。判断标准：如果是5次重复检测，需达到100%检出率；如为分批次20次检测，需至少18次检出核酸。 定量限：使用至少25个重复测量，浓度接近定量限。根据测定结果CV值判断可接受界值，选取CV值等于或小于预期值的最低浓度水平作为定量限。性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW分析特异性交叉试验验证 抗干扰能力验证要求应验证与检测对象可能存在

13、交叉反应的病原体对检测的影响，这类病原体主要是与 检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体。宜在病原体感染的 医学决定水平进行验证。验证方案取一定浓度可能与待测病原体存在交叉反应的病原体 加入标本保存液或经确认为阴 性的标本中，与常规标本一 样处理和检测，至少重复检测3次。可接受标准阴性WHERE分析特异性WHYWHOWHENWHATWHEREHOW分析特异性二性能验证的5W1H交叉反应验证验证要求应验证说明书中涉及的干扰物质对测定的影响。常见的干扰物质主要包括血红蛋白、 甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子、抗核抗体和药物等。需要时也应评估抗凝 剂和标本保存液等对结

14、果的影响。验证方案用相应溶剂溶解干扰物质，配制浓度尽可能为厂家声明浓度的10倍以上。在弱阳性样 本中加入干扰物质溶液，使得干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同，重复测定2次以上。可接受标准结果仍为弱阳性，说明在厂家声明的浓度下，干扰物质对测定无显著影响。二性能验证的5W1HWHYWHOWHENWHATWHEREHOW分析特异性抗干扰能力样本选择：患者标本是进行线性试验理想的标本，且不含有说明书上说明的干 扰物质。选取接近线性范围上限的高值标本与接近下限的低值标本；无法获 取合适的标本可使用添加物或校准品；上述条件均无法满足时，可选用满足 临床需求的高值标本。验证方法：标本分别按比例混合（如5:

15、0、4:1、3:2、2:3、1:4、0:5）或将高值样本 倍比稀释至检测下限，每个稀释度重复测定3次计算均值。结果计算：计算各浓度理论值与对数值差值，计算回归方程Y= bX + a和回归 系数，验证线性范围。判断标准：通常r值应0.98；b在0.971.03范围内，a接近于0；且各浓度的 理论值与实测值对数值的差值0.4。否则， 判定为未通过线性范围验证。二性能验证的5W1HWHYWHOWHENWHATWHEREHOW线性区间y = -1.050 x + 8.852 R = 0.999246810002468可报告区间只有经验证的线性范围上限不能满足临床需求时的定量检验项目。验证方案：选择在线

16、性范围内高值标本，用试剂盒配套或指定的稀释液做系列等倍比稀 释。每份标本至少测定2次取平均值， 计算各稀释度的理论值与实测值对数值的差值。结果判断：如果某稀释度的理论值与实测值对数的差值0.4，表明在此稀释度下结果 可靠。可报告范围上限为线性范围的上限值* 保证结果可靠的最大稀释倍数，下限为线性范围 下限。性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW可报告区间广方法：将高浓度的样本（3.61E+08） 进行10倍梯度稀释 至线性范围内，将不同稀释度样本进行同批次检测，每 个浓度检测三次，计算稀释后各浓度点的CV值。结果判断：以CV值5%的最大稀释倍数乘以 原始样品 的浓度为

17、可报告范围。可报告范围验证结果：可报告范围可达3.61E+14。性能验证的5W1H二WHYWHOWHENWHATWHEREHOW可报告区间编号浓度值Log均值SDCV2.52E+088.4012.01E+088.308.360.040.49%2.34E+088.376.50E+077.812 5.25E+077.727.740.050.65%4.97E+077.70 4.82E+066.6834.47E+066.656.660.010.21%4.55E+066.664.59E+055.6644.30E+055.635.640.020.34%4.12E+055.614.41E+044.645 4

18、.74E+044.684.650.020.36%4.33E+044.644.21E+033.6264.80E+033.683.640.030.72%4.23E+033.634.44E+022.6575.49E+022.742.700.041.40%5.03E+022.704.25E+011.6384.47E+011.651.370.3827.30%6.98E+000性能验证的5W1H二核酸提取效率验证WHYWHOWHENWHATWHEREHOW特定性能验证验证指标：提取产量核酸纯度提取效率批内精密度二性能验证的5W1H扩增效率验证WHYWHOWHENWHATWHEREHOW特定性能验证扩增效率包括样本和标准品的扩增效率，只有二者扩增 效率