高效液相色谱法

1、高效液相色谱法1简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进展别离侧定的色谱方法。注人的供试品，由流动相带入柱，各组分在柱被别离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监视局“液相色谱仪检定规程定期检定并符合有关规定。色谱柱径一般为3.94.6叩，填充剂粒径为310叩。超高效液相色谱仪是适应小粒径约2叩填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂

2、填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性别离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、外表积、键合基团的外表覆盖度、载体外表基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被别离物质的性质来选择适

3、宜的色谱柱。温度会影响别离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善别离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60。最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的别离通常使用手性填充剂。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、外表积、键合基团的外表覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色

4、谱柱的填充，直接影响供试品的保存行为和别离效果。孔径在15nm（lnm=10?）以下的填料适于分析分子量小于2000。的化合物，分子量大于2000的化合物那么应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在310小仑间。粒径更小约2小仙的填充剂常用于填装微径柱径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。40，为改善别离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60。流动相的pH值应控制在2-8之间.当pH值大于8时，可使载

5、体硅胶溶解;当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高外表覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，或有机一无机杂化填充剂等。检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电

6、化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的量有关，还与化合物的构造有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，构造相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进展计算时，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外-可见分光检测器，所用流动相应符合紫外一可见分光光度法（?中国药典?2015年版四部通那么0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机

7、相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇一水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否那么易导致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。各品种项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径、长度、填充剂粒径、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进

8、样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并到达系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%寸，允许改变围为0.7X1.3X;当X大于33%时，允许改变围为X-10%X+10%。假设需要用小粒径约2叩填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。当对其结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足别离要求的品种，可在该品种正文项下注明。系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、别离度、灵敏度、重复性和拖尾因子等五个参数。按各

9、品种项下要求对色谱系统进展适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进展试验，必要时，可对色谱系统进展适当调整，应符合要求。色谱柱的理论板数(n)用于评价色谱柱的效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或标物质峰的保存时间tR和峰宽(W)或半顶峰宽(Wh/2),按n=16(tRW)2或n=5.54(tRWh/2)2计算色谱柱的理论板数。tR、W、Wh/2可用时间或长度计下同，但应取一

10、样单位。别离度(R)用于评价待侧组分与相邻共存物或难别离物质之间的别离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标.可以通过测定待测物质与杂质的别离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分标物质或其他难别离物质的别离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的别离度，对色谱系统进展评价与调整。无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰与相邻色谱峰之间有较好的别离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的别离度应大于1.5。别离度的计算公式为R=2(tR2tR1)/(Wl+W2)或R=2(tR2一tR1)/1.70

11、(W1.h/2+W2.h/2)式中，tR2为相邻两峰中后一峰的保存时间；tRl为相邻两峰中前一峰的保存时问；W1、W2及Wl.h/2、W2.h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半顶峰宽。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n并口别离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。重复性用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%;采用标法时，通常配制相当于80%.100%?口120%的对照品溶液，参加规定量的标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差

12、应不大于2.0%=拖尾因子T用于评价色谱峰的对称性。拖尾因子计算公式为：T=W0.05h/2di式中，W0.05h为5%W高处的峰宽；di为峰顶在5%W高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离。以峰高作定量参数时，除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之问。以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在各品种正文项下对拖尾因子作出规定。灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比（S/N）来表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定作业指导书指导书编号T

13、YFDC-SOP-FF-028图效液相色谱法第5页共10页第二版批准忠华初审吴雅凝起草郭欣时，信噪比应不小于10;定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。1.3测定法标法按各品种项下的规定，精细称量取对照品和标物质，分别配成溶液，精细量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子校正因子（f）=（As/Cs）/（Ar/Cr）式中As为标物质的峰面积或峰高；Ar为对照品的峰面积或峰高；Cs为标物质的浓度；CR为对照品的浓度。再取各品种项下含有标物质的供试品溶液，进样

14、，记录色谱图，测量供试品中待测成分和标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量含量（cx）=f.Ax/（As/cs）式中，Ax为供试品峰面积或峰高；cx为供试品的浓度；A为标物质的峰面积或峰高；c为标物质的浓度；f为标法校正因子。采用标法，可防止因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。外标法按各品种项下的规定，精细称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精细取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积或峰高），按下式计算含量含量(Cx)=CR(Ax/Ar)式中各符号意义同上。由于微量注射器不易准确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以手动进样器定量

15、环或自动进样器进样为宜。加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精细称(量)取待测物对照品和参比物质对照品各适量，配作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-028图效液相色谱法第6页共10页第二版批准忠华初审吴雅凝起草郭欣制待测物校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测物的校正因子。校正因子=(Ca/Aa)/(Cb/Ab)式中CA为待测物的浓度；Aa为待测物的峰面积或峰高；CB为参比物质的浓度;；Ab为参比物质的峰面积或峰高。也可精细称量取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，进样，记录

16、色谱图，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子。校正因子可直接载人各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。需作校正计算的杂质，通常以主成分为参比，采用相对保存时间定位，其数值一并载人各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液，作为对照溶液，进样，记录色谱图，必要时，调节纵坐标围以噪声水平可承受为限使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%-25%除另有规定外，通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%;含量在0.5%2%的杂质，峰面积的RSD应小于5

17、%;含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保存时间的2倍，测量供试品溶液色谱图各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比拟，计算各杂质含量。不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，假设无法获得待测杂质的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述1.3.3法配制对照溶液、进样调节纵坐标围和计算峰面积的相对标准偏差后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除另有规定外，供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保存时间的2

18、倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比拟，依法计算杂质含量。作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-028图效液相色谱法第7页共10页第二版批准忠华初审吴雅凝起草郭欣面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量进样，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于仪器响应的线性限制，峰面积归一化法一般不宜用于微量杂质的检查。4考前须知流动相的制备与保存用高纯度的试剂配制流动相.必要时照紫外一可见分光光度法进展溶剂检查，应符合要求;水应为新鲜制备的高纯水，可用超纯水器制得或用重蒸馏

19、水。凡规定pH值的流动相，应使用精细pH计进展调节、除另有规定外，偏差一般不超过土0.2pH单位。配制好的流动相应通过适宜的0.45或0.22叱H滤膜滤过，以除去杂质微粒。流动相用前必须脱气，否那么容易在系统逸出气泡，影响泵的工作、色谱柱的别离效率、检测器的灵敏度以及基线稳定性等。流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯等容器，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙睛等可浸出塑料外表的增塑剂，导致流动相受污染。贮存容器一定要盖严，以防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶人流动相引起pH值变化，对别离或分析结果带来误差。磷酸盐、醋酸盐缓冲液容易发霉变质，应尽量新鲜配制使用。如确需贮存，可

20、在冰箱冷藏，并在3天使用，用前应重新滤过。溶液的配制与保存除另有规定外，采用规定溶剂配制对照品溶液和供试品溶液，定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制两份。供试品溶液在注人液相色谱仪前，一般应经适宜的0.45m或22仙M滤膜滤过，以减少对色谱系统产生污染或影响色谱别离。应根据试验要求和供试品的稳定性，设置待测溶液的贮存条件如温度、遮光等。色谱柱的使用.与保存根据实验要求和流动相的pH值围，参照色谱柱说明书，选用适宜的色谱柱。安装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。除另有规定外，不宜反向使用，否那么会导致色谱柱柱效明显作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-

21、028图效液相色谱法第8页共10页第二版批准忠华初审吴雅凝起草郭欣降低，无法恢复。进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡。经色谱系统适用性试验测试，应符合要求。色谱柱在使用过程中，应防止压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者机械震动都会影响柱固定相的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱填料，因此在调节流动相流速时应该缓慢进展。试验完毕后，可按色谱柱的使用说明书，对色谱柱进展冲洗和保存。一般来讲，对于反相色谱柱，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在试验完毕后，应用10倍柱体积0如150mm柱长，约15mL的低浓度的甲醇/乙睛一水溶液10%-20%冲洗，使色谱柱的盐完全溶解洗脱出

22、，再用较高浓度的甲醇/乙睛一水溶液50%冲洗，最后用高浓度的甲醇/乙腊一水溶液80%-100%冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于甲醇或乙睛中，正相柱可以贮存于经脱水处理后的正己烷中，离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05叠氮化钠的水中，并将色谱柱的两端密封。以免于燥，室温保存。流动相的调整为满足色谱系统适用性要求，试验中有时需要调整流动相组分的比例。在调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X1.3X;当X大于33%时，允许改变围为X-10%X+10%。下面举例说明。二元流动相系统。例1两组分比例为50:50

23、按上述原那么，X=50%,33%该流动相比例调节的围是X-10%X+10%,即40:60至60。0例2两组分比例为2:98,X=2%,33%按上述原那么，2%的允许改变围为0.7X1.3X,即1.42.6故该流动相比例调节的围是1.4:98.6至2.6:97.4。三元流动相系统例3三组分比例为60:35:5按上述原那么，可每次调节流动相系统中比例较低的两个组分。对35%的组分，其流动相比例调节的围是X-10%X+10%,即25%-45%那么流动相系统比例的调节围是50:45:5至70:25:5作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-028图效液相色谱法第9页共10页第二版批准忠华初审吴雅

24、凝起草郭欣对于5%的组分，其允许改变围为0.7X1.3X,即3.5%6.5%,那么流动相系统比例的调节围是58.5:35:6.笄61.5:35:3.5杂质检查时色谱参数的设置在进展杂质检查时，选择适宜的检测灵敏度和设定适宜的积分参数非常重要。国药品质量标准中，通常制备与杂质限度相当浓度的对照溶液，用以调节检测灵敏度，使对照溶液的主成分色谱峰的峰高达湖量程的10%5%,再进展供试品溶液的测定，以峰面积计算单个杂质量和总杂质量。目前国色谱数据处理系统大致有积分仪和色谱工作站两种类型，对于传统的积分仪，由于记录仪的满量程是固定的，因此检测灵敏度的调节通常是调节检测器的灵敏度使色谱峰高到达记录仪满量程的某个围；而对于色谱工作站，由于记录标尺的满刻度是可调的，所以通常是调节满刻度的设定值，使色谱峰的量程占满刻度的某个围。无论使用的是积分仪，或者是色谱工作站，如质量标准中没有明确规定峰面积的取舍限值，或没有设定灵敏度测试溶液，那么在实际检验中，实验者通常根据以往经历设定积分参数和小峰面积，