组织切片免疫组化-张

1、组织切片免疫组化雄鼠肾囊膜移植ES cell 4-6周处死小鼠，1多聚甲醛固定4保存（无限时）， 脱水50乙乙醇300minn60乙醇330miin700乙醇醇 过夜夜80乙醇 60mmin990乙乙醇 660miin955乙醇醇 20mmin995乙乙醇 255minn1000乙醇醇 200minn1000乙醇醇 255minn透明 以上上每次移移前快速速用滤纸纸吸，但但不能干干，组织织块轻夹夹，避免免损伤，或者将将组织快快放在离离心管中中，依次次加入不不同浓度度的乙醇醇，每次次更换时时，吸出出大部分分的乙醇醇，将剩剩余的连连组织块块倒在滤滤纸上，再立即即反过来来将组织织块导入入离心管管，再

2、加加下一个个浓度的的乙醇） 液液液之间误误差约为为1miin，进进入后摇摇晃透明 1100乙醇苯（11：1）10mmin 苯 过午午苯 110miin浸蜡蜡浸蜡（662 恒温温箱,将将组织块块放在铁铁网中，挨个转转移）蜡蜡10mmin蜡蜡20mmin蜡蜡 200minn包埋：石石蜡盒底底部事先先用手指指涂点甘甘油，石石蜡未凝凝固时将将组织块块拟切面面朝下中中间放置置，盖上上镂空塑塑料托，石蜡凝凝固后，自来水水，完全全冷却后后，将包包埋盒与与塑料托托分离，组织块块应该留留在托一一边，收收藏好等等待切片片（避尘尘）【蜡若凝凝固于组组织块外外围，将将器皿搁搁酒精灯灯上烤烤烤，化后后移入温温箱】【组织

3、块块由苯移移入蜡时时，瓶边边靠上即即可，不不用滤纸纸，在蜡蜡之间移移动组织织块要快快，尽量量避免凝凝固】【用苯替替代二甲甲苯透明明可放置置较长时时间，组组织块不不易脆】切片展片，贴贴片卧式染缸缸2/3蒸馏馏水+110滴蛋蛋清甘油油， 混混匀；将蛋清甘甘油水溶溶液摸匀匀载玻片片上，磨磨砂面朝朝上；将玻片在在酒精灯灯火焰上上晃3-5下（夏天）或6-8下（冬天）用手术刀刀取一段段适宜长长度的切切片，移移到载玻玻片液滴滴上，光光面朝下下；用展片针针将皱的的组织展展开用手术刀刀分开组组织片段段，移于于另一载载玻片（事先蛋蛋清甘油油水溶液液滋润）中间；组织方向向尽量保保持一致致（根据据形状，或有绒绒毛的朝

4、朝上）置置于片盘盘上，做做好标记记；移入恒温温箱前，不能让让切片干干掉，要要保持适适度湿润润（否则则切片烤烤后不牢牢），但但切片周周围尽量量不要留留有蛋清清甘油，以免染染色后影影响片子子美观；移入488恒温箱箱，烤片片，过夜夜，2天天都行。染色，封封片1.脱蜡蜡 二甲苯苯 3mmin 二甲苯苯 3mmin1100乙醇 5mmin1100乙醇 5mmin995乙乙醇 5mmin995乙乙醇 5mmin990乙乙醇 55minn80乙醇 5miin700乙醇醇5miin自来来水 33minn蒸馏水水 3mmin染染色（或或修复，抗体，显色，如果作作免疫组组化不能能用脱过过伊红的的酒精去去脱水）苏木

5、精精 7mmin（染色前前将漂浮浮的氧化化物用滤滤纸捞起起，要慢慢放慢提提，避免免将沉淀淀悬浮起起）自来来水漂洗洗5miin（置置盆中流流水冲洗洗，水不不能直接接冲在玻玻片上）酸酒精精 浸提提N次（4次）（根据据分色情情况定）自来水水漂洗55minn（回色色） 漂漂洗前先先用自来来水洗一一遍（漂漂洗后观观察分色色情况）蒸馏水水 3mmin 伊红 5miin 若若置于990酒酒精中褪褪色很快快，往伊伊红中加加2000ml冰冰醋酸，搅匀，重复染染色至深深桃红（染色稳稳定后一一般不再再加冰醋醋酸）770乙乙醇 浸浸提800乙醇醇 浸提提90乙醇 3miin955乙醇醇 5mmin995乙乙醇 5mm

6、in1100乙醇 5mmin1100乙醇 5mmin二二甲苯1000乙醇醇（1：1） 3miin二甲甲苯3miin二甲甲苯3miin （浸在二二甲苯中中，一片片封完取取另一片片）封片片封片擦干二甲甲苯中性性树胶滴滴于组织织边盖玻玻片朝上上一面酒酒精灯上上晃一下下（去水水分）盖盖玻片一一边小心心置于树树胶液滴滴外沿轻轻轻盖上上（组织织应在中中间）置置片盘晾晾干（片片盘晾干干）【从脱蜡蜡起直至至封片，注意组组织片均均不能干干】【看片时时，若是是苏木精精颜色有有点发黑黑，说明明透明时时组织干干了】【看片时时，若发发现杂质质，一要要注意苏苏木精染染色时要要去氧化化物，染染色时要要轻放轻轻取，二二要在自

7、自来水漂漂洗前将将水龙头头包上棉棉花，纱纱布过滤滤】免疫组化化：修复柠檬檬酸缓冲冲液放在在烧杯中中，置于于水浴中中，当柠柠檬酸缓缓冲液温温度达到到95度度时，将将玻片放放入柠檬檬酸缓冲冲液中，当温度度达到992度开开始计时时92-98度度30mmin，取出凉凉到室温温，再将将玻片取取出，（柠檬酸酸缓冲液液只能使使用一次次），我我放置了了2.55hr才才取出。然后蒸蒸馏水洗洗，PBBS洗55minn，3次次，最后后一次时时间可长长，1擦去玻玻片周围围的水，放置在在湿盒中中，加BB液，盖盖上湿盒盒；2再取另另一片重重复上一一步，大大约9片片后计时时15mmin；然后全全部结束束；3.时间间到后，从

8、第一一片开始始取出玻玻片用蒸蒸馏水冲冲洗2-3次，放入浸浸在PBBS的架架子上，继续另另一片；4全部部结束后后计时55minn，3次次，期间间提起架架子混匀匀液体;5.最后后一次洗洗涤时间间到后，取出按按照1和和2的步步骤加一一抗，和和空缺一一抗对照照；【注注意放置置一抗过过夜时一一定要放放平湿盒盒，保证证液滴不不流，否否则标本本会干】6重复复3和44步7 重复复5加AA液8重复669重复55加DAAB显色色液6mmin10蒸馏馏水冲洗洗，终止止显色，浸入蒸蒸馏水中中的架子子上；苏苏木精复复染同前前苏木精精染色。直至封封片。试剂的配配制：各级浓度度酒精1伊红红：1gg曙红YY溶于1100mml

9、 770乙乙醇中Harrris (德国国最好) 苏木木精1gg10mml 无无水乙醇醇（充分分溶解）钾矾220g2200mml 蒸蒸馏水搅搅拌煮沸沸 苏苏木色精精，上海海润捷化化学试剂剂有限公公司，进进口分装装；生化化试剂。十二水水合硫酸酸铝钾，广东汕汕头西陇陇化工厂厂苏木精酒酒精液搅搅拌缓慢慢矾液（微沸）即加氧氧化汞00.5gg（逐渐渐少量加加入，边边加入边边搅拌，防止染染液溅出出冷水浴浴(充分分冷却或或过夜)过滤（准备实实验时配配制，若若染不上上再配）红色氧化化汞广东东汕头西西陇化工工厂苦味酸饱饱和水溶溶液 苦苦味酸（2.44.6三硝基基酚）ppicrric aciid酸酒精（1%盐盐酸）

10、11ml盐盐酸 1000ml 70酒精 盐盐酸：广广东汕头头市西陇陇化工厂厂石蜡： 蜂蜡：石蜡=1:99融化过滤滤备用（蜂蜡熔熔点622-677；上海海华永石石蜡有限限公司，华申牌牌，高效效切片石石蜡（hhighh efffecct pparaaffiin ccereesinn）：熔熔点566-588，专供供人体、动植物物组织切切片使用用，上海海华灵康康复器械械厂出品品，复旦旦大学上上海医学学院病理理教研室室监制，华灵牌牌）蛋清甘油油：蛋清清打成水水样，去去泡沫44-5层层纱布过过滤蛋清清：甘油油1：11麝香草草酚（加到到有味即即可） 甘油：广东光光华化学学有限公公司.组织切片片将蜡块用用保安

11、刀刀切成略略梯形，组织上上下留有有空蜡约约4mmm，左右右留有约约3mmm；将贴有蜡蜡块的塑塑料托，装上切切片机，再装切切片刀，粗调刀架架与组织织块平面面距离及及清除角角（将刀刀刃与组组织平面面之间留留一很小小的角度度间隙，约3-8度，以免切切片时刀刀刃面或或其下缘缘将组织织刮坏）细调距离离：左右右手配合合，组织织块转到到上方时时，左手手旋转调调整距离离，反复复到有完完整组织织切片出出现。切切过程再再对清除除角进行行修正；若切片不不挺，可可用冰块块冰镇11minn左右，组织块块上的水水份用毛毛巾轻吸吸，冰镇镇前记住住锁定手手轮，推推上护刀刀架；若切片卷卷曲，表表明刀口口不利，换个位位置再切切（

12、移动动刀架的的锁钮要要轻拉，轻扣（换位前前记住锁锁定手轮轮，推上上护刀架架）切片时要要匀速。切片用用松散的的羊毫毛毛笔松卷卷（从蜡蜡片带背背面托起起），防防止粘连连；将蜡片背背面（光光面）平平铺于片片盘上，并加盖盖，盖子子采用推推拉，不不能用掀掀，否则则切片会会飘起，记住编编号；清扫刀架架上的蜡蜡片时，用毛笔笔往刀口口方向扫扫，以防防切割；切好后片片盘托起起搁4，并注注明：品品名，制制作人，时间；锁定手轮轮，推上上护刀架架。组织脱水水浸蜡过过程详解解 HYPERLINK httpp:/n(20010-07-15 18:33:49)-组织经过过透明剂剂的完全全透明后后，被移移放于665左右熔熔化

13、的石石蜡中，于655的电热热恒温箱箱中浸渍渍的过程程称为浸浸蜡。组织在脱脱水时，组织中中的脂类类和类脂脂等物质质在脱水水剂的作作用下被被溶解掉掉，留下下了许多多腔隙，许多管管腔组织织和血管管，也有有许多腔腔隙，这这些都严严重地影影响了切切片。组组织浸蜡蜡时，由由于诱导导剂（二二甲苯）的作用用，石蜡蜡进入到到组织的的各个角角落，并并在各个个角落中中保存下下来。当当石蜡包包埋后冷冷却时，这浸入入到里面面的石蜡蜡便可起起到支撑撑的作用用，而且且使组织织不致于于变形，塌陷等等现象，使切片片能完整整的切出出，便于于镜下观观察。组织浸蜡蜡据多次次文献报报到必须须换几次次不同熔熔点的石石蜡。石石蜡有软软蜡和

14、硬硬蜡之分分，软蜡蜡的熔点点有455、522544。硬蜡蜡的熔有有5658，588600、600622。浸蜡蜡的顺序序 是先先软蜡，后硬蜡蜡，浸蜡蜡的时间间根据组组织不同同而确定定不同的的时间。有的人人指出组组织浸蜡蜡先放入入二甲苯苯与石蜡蜡等份混混合的液液体中浸浸渍然后后再放入入软蜡、硬蜡。根据使使用经验验我认为为不必要要这样做做。因为为组织经经二甲苯苯或其它它透明剂剂透明后后，在组组织进入入石蜡时时，自己己还带着着残存的的透明液液，如为为手工操操作，可可将组织织块控干干，尽量量减少残残存液的的存在，而自动动脱水机机则不然然，组织织可存留留一定量量的透明明剂，经经使用次次数多次次后，残残存的

15、透透明剂可可把石蜡蜡稀释。因此机机器程序序处理的的次数较较多时，应注意意换石蜡蜡，以防防组织浸浸蜡效果果不好。一、石蜡蜡的性质质 石蜡是一一种碳氢氢化合物物，由矿矿物油的的分裂产产生，它它的性质质是相当当的不同同，其熔熔点在445662之间。熔点高高的为硬硬蜡，硬硬度较高高，适合合于夏天天切片的的用蜡，熔点低低的为软软蜡，554以下的的称为软软蜡，这这种适合合于组织织化学的的切片用用蜡。根根据石蜡蜡的特点点，根据据季节的的不同，合理地地使用不不同熔点点的石蜡蜡，这是是能否切切好片，使切片片产生带带状的关关键。二、石蜡蜡性质的的改善为了获得得较好的的连续切切片，人人们想出出了许多多种方法法，对石

16、石蜡进行行改造，使石蜡蜡的硬度度和柔软软性更适适合于佳佳片的切切出，提提出了许许多种方方法：石蜡加热热冷却法法 刚购入的的石蜡,不管是是动植物物切片石石蜡也好好,还是是工业用用蜡也好好,都必必须进行行处理,方法是是:将石石蜡放于于容器里里,于电电炉上加加热,此此时石蜡蜡遇热熔熔解并发发出哔哔哔吧吧的的声音,这是石石蜡中含含有的杂杂质,遇遇热后分分解所发发出的声声音,随随着时间间的延长长,温度度的升高高,这种种声音将将逐渐减减少,直直至消失失。此时时可将盛盛装石蜡蜡的容器器浸入冷冷水中，石蜡凝凝结后，再继续续加热，如此反反复几次次即熔化化冷却熔化冷却。这种处处理方法法，可增增加石蜡蜡的密度度和可

17、塑塑性，除除去杂质质。为达达高质量量的切片片，这是是必经之之法。增加和改改善石蜡蜡的韧性性和粘度度 这种方法法则需要要加入一一些东西西才能获获得，如如蜂蜡和和硬脂肪肪，蜂蜡蜡最高熔熔点可达达70余余度，增增加它可可增加石石蜡的硬硬度。石石蜡切片片切45umm，600左右的的石蜡可可支撑得得起，如如要切113uum，其其硬度则则不够，因此，要制出出较薄的的切片，石蜡硬硬度一定定要过关关。另外，增增加石蜡蜡的硬度度还可以以加入脂脂蜡酸、柏油、杨梅蜡蜡等，虽虽然如此此，石蜡蜡经处理理后，用用时的颜颜色如肥肥皂一样样为最好好。在了解了了石蜡的的性质及及如何改改造它后后，下面面再了解解组织浸浸蜡。三、传

18、统统浸蜡法法这是手工工操作和和不带真真空负压压的浸蜡蜡方法。根据石石蜡的熔熔点，确确定浸蜡蜡箱的温温度。如如硬蜡的的熔点为为62,浸蜡蜡箱的温温度应比比石蜡熔熔点高出出233，即浸浸蜡箱调调在655，当确确定好后后，将组组织放入入软蜡，后转入入硬蜡，根据不不同的组组织，组组织的大大小来确确定浸蜡蜡时间，小组织织2030分分钟，大大组织几几个小时时不等。四、真空空负压浸浸蜡法真空负压压浸蜡法法应用一一真空泵泵，将箱箱内的空空气抽出出来，形形成真空空负压，在这种种条件下下，由于于失重，各种分分子活动动加快，促使浸浸蜡过程程迅速完完成。为为了浸蜡蜡完全彻彻底，全全密闭自自动脱水水机配有有这一功功能。

19、 浸蜡方法法鼻咽部、宫内膜膜穿剌物物、排出出物甲状腺、肝、脾脾肾、淋淋巴结子宫肌、平滑肌肌胃、肠肠、横纹纹肌等所需温度度传统浸蜡蜡法40990 mmin901150 minn180 minn以上65度真空负压压浸蜡法法15 mmin25330 mmin601120mmin70度 真空负压压所需压压力表40KPP40553KPP66.77KP真空负压压浸蜡法法使用时时的注意意事项：真空恒温温干燥箱箱的温度度应略高高于传统统浸蜡法法，因为为在抽气气形成真真空时，箱中的的热气会会被抽出出，致使使箱中温温度下降降，使熔熔化的石石蜡凝结结成块，所以温温度调至至70度度左右为为宜。 计时应从从浸蜡完完全熔

20、化化时计起起。抽气气时，箱箱中的温温度下降降，此时时浸组织织块的蜡蜡如果处处于凝固固时，应应待其熔熔化后，方可计计时。 附：几种种组织处处理程序序。 (1)、常规组组织处理理程序11、组织织块冲水水24小小时。22、700%酒精精24小小时。33、 880%酒酒精122小时。4、 90%酒精112小时时。5、 955%酒精精（1）2小时时。6、 955%酒精精（2）2小时时。7、 1000%酒酒精（11）1小小时。88、 1100%酒精（2）11小时。9、 二甲苯苯（1）3060分分钟。110、二二甲苯（2）33060分分钟。111、 软蜡11小时。12、 硬蜡蜡23小时时。(2)胃胃肠粘膜膜处理程程序1、70%酒精110miin。22、 880%酒酒精100minn。3、 900%酒精精10 minn。4、 955%酒精精10mmin。5、 1000 %酒酒精100minn。6、 二甲甲苯510 minn。7、 浸蜡蜡15 minn。 (3)临临床手工工脱水