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1、藤黄菌素体外对重组人卵白激酶CK2全酶的按捺作用林小聪,刘新光,陈小文,陈伟珠,梁念慈【关键词】酶动力学InhibitryeffetflutelinnrebinanthuanprtEinkinaseK2hlenzyeinvitr【Keyrds】prteinkinaseK2;rebinantprteins;hlenzye;lutelin;enzyekinetis【摘要】目的:不雅察体外藤黄菌素对重组人卵白激酶K2的按捺结果及举行酶动力学阐发以确定其按捺作用范例.要领:使用基因工程技能举行克垄表达和纯化,得到重组人K2的及亚基,并在体外等摩尔混淆构成K2全酶.通过测定药物作用后转移到K2底物上的3
2、2PATP的32P的放射性活度来检测藤黄菌素对酶的按捺作用及接纳LineeaverBurk作图法阐发其动力学.结果:藤黄菌素能明显按捺重组人卵白激酶K2的活性I50=0.86l/L.酶动力学阐发表白,藤黄菌素与ATP呈竞争性按捺K2的活性Ki=0.19l/L,与酪卵白那么呈混淆性按捺K2的活性Ki=0.11l/L.结论:藤黄菌素是一种较强的体外卵白激酶K2的按捺剂.【关键词】卵白激酶K2;重组卵白;全酶;藤黄菌素;酶动力学0弁言卵白激酶K2全酶是由2个催化亚基(和/或)及2个调治亚基()所构成的异源四聚体,重要有22,22或23种情势1-2,具有埋伏的致瘤活性并与肿瘤的产生有着严密的接洽3.藤
3、黄菌素(lutelin)大概会影响K2的活性,因此我们选择藤黄菌素作为研究工具,在已克垄表达和纯化人K2及亚基的底子上4-5,探究其对重组人卵白激酶K2全酶的按捺作用及其动力学,为进一步探求新型的抗肿瘤和抗病毒药物奠基精良的底子.1质料和要领11质料藤黄菌素为Aldrih公司产物.组卵白S,多聚谷氨酸和酪氨酸复合物Ply(GluTyr)41,肝素,精胺和ATP购自Siga公司.5,6二氯1呋喃糖苯并咪唑(DRB)为albihe公司产物.P81磷酸纤维素滤纸购自hatan公司.32PATP为北京福瑞生物医学工程公司消费.12要领人K2和亚基DNA重组质粒pTKA和pTKB的克隆与测序见文献4.重
4、组人K2和亚基的原核表达、纯化与断定见文献4-5.卵白定量:按通例的考马斯亮蓝G250染色法,以牛血明净卵白作为尺度.卵白激酶K2的活性测定要领见文献6.将纯化的重组人K2与亚基按等摩尔(14pl)混淆构成重组人K2全酶.在每个反响管中别离参加差异浓度的藤黄菌素10L,参加反响混淆液15L,以全酶10L启动反响不雅察藤黄菌素对K2全酶活性的影响.按照半数效量概率单元法11盘算I50.以浓度的对数为横坐标,相应浓度按捺率的概率单元(prbit)为纵坐标,求出直线回归方程,并按照方程盘算I50值(50%按捺时的概率单元为5).按照I50结果,选择3种浓度的藤黄菌素(0,1,2l/L)举行分组.在酪
5、卵白浓度为2g/L,ATP浓度为10,20,40,80l/L环境下测定K2的活性;或在结实ATP的浓度为10l/L,改变酪卵白浓度(1,2,4,8g/L)条件下测定K2活性,每个样品同时做3个平行管,接纳LineeaverBurk作图法求出酶动力学参数表不雅K和表不雅Vax,以此断定藤黄菌素对K2按捺作用范例.2结果21重组人K2全酶的性子将重组人K2与亚基等摩尔混淆后构成的重组全酶,具有与自然K2同等的性子,可用酪卵白作底物;而用组卵白S和TPK的底物Ply(GluTyr)41作底物时,K2的活性那么很低表1.别的,重组人K2全酶的活性受到肝素和K2特异性按捺剂DRB的按捺,精胺那么有激活作
6、用.而一些第二信使分子,如AP,GP和a2+那么对K2的活性根本没有影响表2.表1差异底物存鄙人测定的重组人卵白激酶K2全酶活性(略)22藤黄菌素对重组人K2全酶的直接作用向反响体系中参加0.50,0.75,1.00,1.25,1.50,2.00l/L藤黄菌素,其K2活性占比较组K2活性的百分数别离为(61.51.6)%,(54.10.6)%,(50.77.2)%,(46.45.6)%,(33.53.9)%,(15.94.3)%;提示藤黄菌素对重组人K2全酶有较强的按捺作用,且随着藤黄菌素浓度的不竭增长,K2全酶活性渐渐低落,出现浓度依靠性干系;直线回归方程为:Y=1.9987X-0.8502
7、,r2=0.8203(P0.05);按照方程盘算的I50值为0.86l/L.表26种化合物对重组人卵白激酶K2全酶活性的影响(略)图1差异ATP浓度环境下LineeaverBurk作图法得出藤黄菌素对重组人K2全酶按捺作用的动力学(略)图2差异酪卵白浓度环境下LineeaverBurk作图法得出藤黄菌素对重组人K2全酶按捺作用的动力学(略)3讨论【参考文献】1LithfieldD.PrtEinkinaseK2:Struture,regulatinandrleinellulardeisinsflifeanddeathJ.BiheJ,2022,369(Pt1):1-15.2黄功华,刘新光,梁念慈.
8、卵白激酶K2的研究希望J.生命的化学,2022,23(3):169-171.3HessenauerA,ntenarh,Gtz.InhibitinfK2ativityprvkesdifferentrespnsesinhrnesensitiveandhrnerefratryprstateanerellsJ.IntJnl,2022,22(6):1263-1270.4陈小文,刘新光,梁念慈.人卵白激酶K2亚基在大肠杆菌中的克垄表达及其重组卵白的纯化及性子断定J.中国生物化学与分子生物学报,2022,20(2):176-182.5刘新光,梁念慈,马涧泉.重组人K2亚基的原核表达、纯化与断定J.生物化学与生物物理希望,2000,27(2):201-205.6刘新光,梁念慈.AG1109对重组人卵白激酶K2全酶的按捺作用J.癌症,2002,21(2):153-157.7BlanquetPR.aseinkinase2asaptentiallyiprtantenzyei
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