结肠癌肿瘤自身抗体谱筛选及其应用

1、结肠癌肿瘤自身抗体谱挑选及其应用结肠癌是在西欧国度发病率位居第二的癌症，在我国结肠癌的发病率如今排第五位。比年来，其发病率还在逐年上升。如今早期结肠癌的诊断率仍很低，约1/4的患者在初次确诊时已有远处转移，此中50%是肝转移。最新的肿瘤免疫学研究以为，病人可对自身肿瘤抗原产生体液免疫应答1。正常细胞向癌细胞转化历程中，突变的基因或种种非常表达的卵白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反响，在肿瘤患者血清中可以检测到肿瘤相干抗原的自身抗体谱2。进一步的研究创造在肿瘤患者和正凡人的血清中肿瘤自身抗体谱存在明显差异3，提示自身抗体谱有大概作为肿瘤早期诊断的新型血清标记物。基于这个理论，我们构建患者结肠癌构

2、造的dna表达文库，挑选告终肠癌相干自身抗体谱，并探究将其作为结肠癌早诊的血清学标记物的大概。1资料和要领1.1资料结肠癌构造来自中国医学科学院肿瘤病院收治的1例男性结肠癌患者，病理诊断为低分化型腺癌，肝多发转移，淋逢迎转移6/18，为本院腹部外科手术切除，手术同时取该病人血清。其他30例结肠癌术前病人血清来自本院查验科。手术猎取的癌构造和患者血清及30例康健正常志愿者的血清网罗后立即冻于-80备用。1.2要领1.3统计学要领统计各个阳性克隆在正凡人及结肠癌病人血清中的抗体阳性率，用2查验举行统计学处置惩罚。2效果2.1构建库容为5105pfu的人结肠癌dna表达文库共提取rna10g,d26

3、0d280值为2.05,说明其纯度较高，1%琼脂糖凝胶电泳表现其为从9.40.5kb的弥散，重要会合于1.52.0kb摆布，表白提取的rna质量较好，没有显着的落解。以提取的5g结肠癌构造rna为模板，在合成dna第一链和第二链的同时随机掺入32p。电泳后放射自显影表现，第一链为介于9.00.5kb的弥散，大部门会合于1.52.0kb摆布,无显着的条带；dna第二链的范畴比第一链稍大，为介于10.00.5kb的弥散，大部门会合于1.52.0kb摆布，也无显着的条带。效果表白，使用高温反转录酶乐成地对rna举行了反转录，合成的dna第一链涵盖了绝大多数的rna分子，造成随后合成的第二链同样涵盖了

4、绝大多数的rna分子。取100ngdna与zapexpress载体毗连后，用gigapakgldlningkit提供的包装卵白举行包装。得到库容为5105pfu的结肠癌构造dna表达原始文库。文库不经扩增直接用于抗原筛眩2.2从结肠癌构造dna表达文库中挑选出了33个与患者血清反响的克隆a：第一轮挑选；b：第二轮筛眩实心箭头所示为第一、二轮挑选的阳性克隆，空心箭头为在第一轮挑选中呈阳性而在第二轮挑选中呈阴性的克隆图1文库血清学挑选得到的阳性克隆2.3同源性阐发阳性克隆基因代表29个差异基因对得到的33个阳性克隆起首举行内部剪切。用eri和xhi双酶切断定外源插入片断的大校此中31个阳性克隆剪切

5、乐成，片断巨细在0.52.0kb之间。将这些克隆举行核苷酸序列测定。核苷酸序列表现31个克隆代表差异的抗原分子。进入genbank举行est同源性比力创造，有29个克隆与genbank已有的est具有较高的同源性，如表1所示。余下2个克隆的序列与genbank已报道的est或基因的外显子序列无显着同源。表1部门结肠癌dna表达文库的阳性克隆的同源性阐发2.4阳性克隆与正凡人血清反响性显着低于结肠癌患者我们检测了4个阳性克隆与30例结肠癌患者血清和30例正凡人血清的反响环境。图2是1克隆与5例结肠癌和5例正凡人血清的反响环境。1克隆与肿瘤患者的血清反响显着强于正凡人血清。1、29、21克隆在正凡

6、人血清中抗体阳性率较低，均小于23%，而在结肠癌病人血清中抗体阳性率较高均大于77%，见表2，2查验效果表现有明显性差异p0.01，提示其有大概成为结肠癌早期诊断的血清学标记物。14与正凡人和结肠癌患者血清的反响性相似。以1、29、21三个克隆中恣意一个阳性为诊断尺度，那么对上述30例癌和30例正常的诊断特异性和敏感性别离达90%和70%。假设以1、29、21三个克隆中恣意两个阳性为诊断尺度，那么对上述30例癌和30例正常的诊断特异性和敏感性别离达80%和100%。a：肿瘤血清；b：正常血清图21克隆与5例结肠癌阳性反响和与5例正凡人血清阴性反响表21、29、21、14与正凡人及结肠癌病人血清

7、反响的阳性率克隆号正常血清阳性率病人血清阳性率卡方查验123%(7/30)76%(23/30)p0.01296%(2/30)80%(24/30)p0.01210%(0/30)77%(23/30)p0.011466%(20/30)73%(22/30)p0.053讨论本研究接纳serex技能对结肠癌肿瘤自身抗体谱举行了研究，得到了31例阳性克隆，代表了31种结肠癌肿瘤自身抗体。此中有两个克隆与的est和人的dna外显子序列无显着同源，有报道这些序列表达的肽段大概是模拟了某些抗原分子的表位而被肿瘤自身抗体所识别8。别的29例阳性克隆包罗人线粒体基因，自身抗原，分子朋友，dna修复酶，细胞膜外貌卵白，

8、核糖体卵白及一些如今成效尚未确定的基因等，此中既有产生了点突变及缺失的基因，也有未产生突变的基因。好比，3是人跨膜卵白酪氨酸激酶同源卵白,i型糖尿病自身抗原，属于癌症非依靠性自身抗原。4、22、21、23、27均为人线粒体基因组片断，8、15均为核糖体卵白，应属于癌症相干自身抗原，其在正常构造及肿瘤构造均有表达，在肿瘤坏死时被表暴露来，从而被免疫体系所识别，产生体液免疫应答。此中1，尿嘧啶dna糖基化酶，重要到场dna复制时错配的修复；14人apex核酸酶(多成效dna修复酶)基因；二者都到场dna的复制及修复。这些抗原基因是通过何种机制诱发肿瘤患者产生自身抗体，它们又是怎样到场结肠癌的产生生

9、长的呢？这仍需一步的研究。肿瘤自身抗体谱作为肿瘤血清诊断的新型标记物的应用远景和代价已渐渐被学界成认，这一范畴的研究已渐渐成为肿瘤血清诊断的新型标记物研究的热门。2022年，ang等8报道他们通过雷同的要领得到的22个前线腺癌抗原对付前线腺癌的诊断的敏感性到达了81.6%，特异性到达了88.2%，显着高于psa诊断的效果。他们的这一研究被新英格兰医学杂志评为比年来分子诊断标记物的最紧张的希望9。2022年的一项最新研究报道也表现，卵白芯片检测自身抗体谱技能可以提早于临床诊断5年创造约80%的处于“癌前阶段的患者，证实该技能在癌前病变的筛查中也具有非常紧张的作用10。本研究对新创造4个结肠癌自身抗体作为结肠癌血清标记物的潜能举行了研究。效果创造：1、29、21在正凡人血清中抗体阳性率较低，均小于23%，而在结肠癌病人血清中抗体阳性率较高，均大于77%,2查验效果表现有明显性差异p0.01。应用多个分子标记物团结诊断肿瘤已经成为学界共鸣。我们应用这三个标记物团结阐发也显着地进步了诊断的敏感性和特异性，说明其可以或许成为结肠癌早期诊断的血清学标记物。我