基因重组蛛丝蛋白聚乙烯醇复合支架材料的制备

1、PAGE PAGE 9基因重组组蛛丝蛋蛋白-聚乙烯烯醇复合合支架材材料的制制备魏梅红涂涂桂云陈陈登龙李李敏基金项目目：国家家自然科科学基金金（30057009566）；福建省省发改委委项目（20006-7781）作者单位位：35500007福州州福建师师范大学学生命科科学学院院（魏梅红红、涂桂桂云、李李敏），化学与与材料学学院（陈登龙龙）通信作者者：李敏敏，Emaail:mliin【摘要】目的探讨讨致孔剂剂NaCCl粒径径和比例例、变性性剂和聚聚乙烯醇醇（PVAA）等因素素对基因因重组蛛蛛丝蛋白白- PPVA复复合支架架材料形形态及性性能的影影响。方方法基因因重组蛛蛛丝蛋白白溶解于于98%甲酸

2、，采用冷冻干干燥粒子子滤沥法法制备重重组蛛丝丝蛋白-PVAA复合多多孔支架架，采用用扫描电电子显微微镜观察察支架的的形态，采用单纤纤维强力力试验机机测试支架架机械性性能。结结果乙醇醇作变性性剂制得得的多孔孔支架力力学性能能较好，支架架的断裂裂应力、断裂比比强度均均提高5倍倍，断裂裂伸长率率可达112.221%。以粒径 5000m的NaCCl为致致孔剂制制得的多多孔支架架力学性性能较好。高分子子材料PPVA能能明显改改善重组组蛛丝蛋蛋白多孔孔支架的的性能。 结论论重组蛛蛛丝蛋白白-PVAA复合支支架材料料有望在在组织工工程领域域得以应应用。【关键词词】重组蛛蛛丝蛋白白；冷冻干干燥；聚乙烯烯醇；支

3、架Prepparaatioon oof rrecoombiinannt sspidder sillk pprotteinn/pollyviinyll allcohhol commpossitee sccafffolddmatteriialWWEI Meii-hoong, TUU Guui-yyun, CHHEN Denng-llongg,LII Miin*. *Colllegge oof LLifee Sccienncess,Fujjiann Noormaal UUnivverssityy,Fuuzhoou 33500007,ChiinaCorrrespponddingg auuthoor:L

4、I MMin, Emmaill:mlliffjnuu.eddu.ccnSncllusiionssldss ,CChinna【Absstraact】ObjeectiiveTTo iinveestiigatte tthe efffectts off maany facctorrs ssuchh ass pooroggen,dennatuurannt aand pollyviinyllalccohool(PPVA) poolymmer on thee sttruccturre aand mecchannicaal oof rrecoombiinannt sspidder sillk pprottei

5、nn/PVAA coompoositte sscafffolldmaaterriall. MethhodssThee siilk fibbrouus pprotteinn sooluttionn waas ppreppareed bby ddisssolvvingg thhe rrecoombiinannt sspidder sillk pprotteinn inn 988% fformmic aciid, recoombiinannt sspidder sillk pprotteinn / pollyviinyllalccohool(PVAA) coompoositte pporoous s

6、caaffooldss weere preeparred by freeezee-drryinngparrticcle-leaachiing metthodd.Scannninng eelecctroon mmicrrosccopee waas uusedd too obbserrve theeconnforrmattionnof thee sccafffoldds, sinnglee sttrannd sstreengtth ttesttingg maachiine wass ussed to tesst tthe mecchannicaal pproppertty oof tthe sca

7、affooldss.ResuultssIt inddicaatedd thhat usiing ethhanool aas ddenaaturrantt, tthe mecchannicaal pproppertty oof tthe scaaffooldss iss beetteer, thee brreakkingg sttresss aand breeak speeciffic tennaciity enhhancces 5 ttimees, thee brreakkingg ellonggatiion rattio cann reeachh 122.211%. Usiing NaCCl

8、 (5500m) as porrogeen,or tthe inttrodducttionn off PVVA ccan impprovve tthe perrforrmanncess off poorouus sscafffolld eeviddenttly.ConcclussionnReccombbinaant spiiderr siilk prooteiin / PVVA ccompposiite porrouss sccafffoldds wwilll haave a pprosspecctivve aappllicaatioon iin ttisssue enggineeeriing

9、.【Keyywordds】Recoombiinannt sspidder sillk pprotteinn； LLyopphillizeed；Polyyvinnylaalcooholl； Scafffollds在组织工工程中，种子细细胞、支支架材料料以及细细胞生长长调节因因子被称称为组织织工程三三大基本本要素11。其其中支架架材料在在组织工工程研究究中起中中心作用用，它不不仅为细细胞、组组织提供供结构支支撑和模模板作用用，还可可作为活活性因子子的缓释释载体，促进细细胞的生生长、分分化和增增殖2，3。寻找找一种既既具有良良好生物物相容性性、生物物降解性性，又具具有连通通三维多多孔结构构及优良良的

10、力学学性能的的支架材材料是组组织工程程的研究究热点。丝纤维蛋蛋白具有有较好的的生物相相容性、生物降降解性、韧性及及高强度度，可广广泛应用用于生物物医学领领域，如如酶固定定4、人造血血管5、哺乳乳动物细胞胞培养6、肌腱7与韧带组组织工程程8等。天然蜘蛛蛛丝是一一种特殊殊的丝纤纤维蛋白白，高强度度、高韧韧性和高高弹性等等优良性性质使其其成为近近年来生生物医学学领域研研究的热热点之一一。天然蛛蛛丝蛋白白的获得得并非易易事，基基因工程程技术为为获取重重组蛛丝丝蛋白开开拓了渠道道。本室曾报报道成功功地将RRGD（精氨酸酸-甘氨酸酸-天冬氨氨酸）三三肽与蛛蛛丝蛋白白基因融融合表达达，从而而规模化化地获得得

11、重组蛛蛛丝蛋白白9,110。本实验验以基因重组组蛛丝蛋蛋白为基基础原料料，采用用冷冻干干燥粒子子滤沥法法制得重重组蛛丝丝蛋白/聚乙烯烯醇（PPVA）复合支架架材料，探讨致致孔剂NNaCll粒径和和比例、变性剂剂以及PVVA等因素对支支架形态态及性能能的影响响。材料与方方法一、材料料1.主要要试剂：重组蛛蛛丝蛋白白（本室室自制），98%甲酸及及甲醇（分分析纯，上海化化工厂）、乙醇醇（分析析纯，广广东汕头头西陇化化工厂）、聚乙烯烯醇(PPVA-1177、PVAA-1224) （分析析纯，广广州新易易化工有有限公司司）。2.主要要仪器:Lyollab330000冷冻干干燥仪（丹麦Heeto公公司）、

12、BH-2显微微镜（日本Ollymppus公公司）、KYKKY AAMRAAY-110000B扫描描电子显显微镜（中国科学学院仪器器厂）、YP2202NN电子天天平（上上海精密密科学仪仪器有限限公司）。二、方法法1.重组组蛛丝蛋蛋白-聚乙烯烯醇多孔孔复合支架架的制备备：取一定量冻干的的重组蛛蛛丝蛋白白粉溶解解于988%甲酸酸，配成成30%的重组组蛛丝蛋蛋白-甲酸溶液液，与100%(ww/v)PVAA溶液按按一定体体积比混混合后，再按比例例（重组组蛛丝蛋蛋白与NNaCll的质量量比为11：1）加入NaaCl颗颗粒，混合均均匀。所得混合合液倒入膜膜具（1cm3cm），经55干燥、甲醇或或乙醇变变性、

13、单蒸水水浸泡沥盐盐、冷冻干干燥，即即得重组组蛛丝蛋蛋白-聚乙烯烯醇多孔孔复合支支架。2.复合合支架的的表征:(1)扫描电电子显微微镜观察察:支架材材料表面面喷金，扫描电电子显微微镜下观观察。(2)机械性性能测定定:用YGG0011单纤维维强力试试验机测测定支架架材料的的拉伸断断裂比强强度、拉拉伸断裂裂伸长率率、拉伸伸断脱比比功、拉拉伸断脱脱伸长率率。结果1.变性性剂对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响:分别以以甲醇和和乙醇为为变性剂剂，探讨讨其对支支架力学学性能的的影响，结果见见表1。可看出出乙醇作变性剂剂时，支支架材料料的断裂裂应力、断裂比比强度均均为以甲甲醇为变变性剂的的5倍，且断裂

14、裂伸长率率可达112.221%，以甲醇醇作变性性剂时，支架的的断裂伸伸长率仅仅达到110.997%。表1变性性剂对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响T项目变性剂甲醇乙醇断裂应力力（cNN/ mmm2）79941844断裂比强强度（ccN/ddtx）0.06620.3227断裂伸长长率（%）10.99712.2212. NNaCll颗粒大大小对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响:以不同同粒径大小小NaCCl颗粒粒做致孔孔剂，多多孔支架架材料的的孔径均均可以达达到1000mm左右，但粒径径小于5500m的NaaCl颗颗粒制得得的支架架孔径较较为均一一，连通通性较好好。见图1。A.粒径5

15、00m B. 粒径500m 图1 不同大小NaCl颗粒为致孔剂的共混多孔支架扫描电镜NaCll粒径小小于5000m时多孔孔支架的的拉伸断断裂比强强度为为0.9924 cN/dteex，拉伸断断脱伸长长率为37.55%，拉伸断断脱比功功Wr为为2.882699J/dteex，三三个指标标均比NNaCll粒径大大于5000m时制制得的多多孔支架架高，说说明NaaCl粒粒径小于于5000m时制制得多孔孔支架的的力学性性能较好。见表22。表2NaaCl颗颗粒大小小对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响项目NaCll粒径5000mNaCll粒径5000m拉伸断裂裂比强度度（ccN/ddtexx）0.

16、92240.7338拉伸断脱脱伸长率率(%)37.55531.009拉伸断脱脱比功WWr(J/ddtexx)2.822690.633813.PVVA对多多孔支架架材料力力学性能能的影响响： PVVA-1244含量只只有0%时，支支架的几几个重要要数据都都无法测测得，比较PPVA-1244含量2%和4%时，含含量增高拉伸伸断脱伸伸长率、拉伸断断裂比强强度和拉拉伸断脱脱比功均均随着增增大；比比较PVVA-1124含含量4%和6%时，含含量增高拉伸伸断脱伸伸长率就就大；而而对于拉拉伸断裂裂比强度度和拉伸伸断脱比比功，在在PVAA含量高高时，这这两个数数据反而而低。这这说明支支架中含含有一定定量的PP

17、VA，可以提提高支架架的强度度。见表3。表3PVVA-1124用用量对多多孔支架架力学性性能的影影响项目PVA-1244用量 (%)0246拉伸断裂裂比强度度（ccN/ddtexx）-0.68820.79900.7338拉伸断脱脱伸长率率(%)-22.88325.99731.009拉伸断脱脱比功WWr(J/ddtexx)-0.288390.933530.63381注：“-”表示示由于样样品原因因，没有有测得数数据4.PVVA的聚合度度对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响：就复合合效果而而言， PVAA-1224与PPVA-1177 相比比，前者者拉伸断断脱伸长长率为25.97%，稍差差于

18、后者者26.98%；但是复复合PVVA-1124后后，支架架的拉伸伸断裂比比强度为为0.7790 cN/dteex、拉伸断断脱比功功为0.993533J/dteex，均明显高高于复合合PVAA-1117制成成的支架架。见表4。表4PVVA的聚合度度对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响项目PVA-1177PVA-1244拉伸断裂裂比强度度（ccN/ddtexx）0.49980.7990拉伸断脱脱伸长率率(%)26.99825.997拉伸断脱脱比功WWr(J/ddtexx)0.500510.93353讨论醇类作为为凝固剂剂，可以以诱导折叠构构象的形形成，其其中以甲甲醇和乙乙醇最为为常用。因甲

19、醇醇有较强强的毒性性，对人人体的神神经系统统和血液液系统影影响大，它经消消化道、呼吸道道或皮肤肤摄入都都会产生生毒性反反应，甲甲醇蒸气气能损害害人的呼呼吸道黏黏膜和视视力，所所以考虑虑能否以以乙醇代代替甲醇醇作为凝凝固变性性剂。本本实验比比较了分分别以甲甲醇、乙乙醇为变变性剂，制得支支架材料料力学性性能的差差异。以以乙醇为为变性剂剂制得支支架材料料的断裂裂应力、断裂比比强度均均约为以以甲醇为为变性剂剂的5倍倍，且断断裂伸长长率可达达12.21%。这可可能是因因为乙醇醇的R基基团大，诱导折叠结结晶区的的形成缓缓慢，分分子排列列整齐产产生的分分子应力力也较大大，所以以制得支支架材料料力学性性能好。

20、以不同颗颗粒大小小致孔剂剂制得的的多孔支支架，它它们的孔孔径约1100m以上上，均能能满足一一些细胞胞生长的的要求。以NaaCl晶晶体为致致孔剂的的多孔支支架力学学性能稍稍好，这这可能是是因为晶晶体颗粒粒小，支支架内部部分子(蛋白质质和PVVA-1124)接触反反应机会会比较多多，所以以力学性性能好；相反地地，NaaCl颗颗粒大，由于互互相之间间的排挤挤，造成成支架内内部分子子(蛋白白质和PPVA-1244)接触反应少，势必会会造成力力学性能能变差。单独重组组蛛丝纤纤维制备备支架材材料韧性性不够，所以期期望通过过与其它它聚合物物混合改改善性能能。PVVA是一一种含有有大量羟羟基的聚聚合物，羟基

21、是是强亲水水基团，因此PPVA是是水溶性性高分子子。PVVA具有有很好的的成膜性性、耐磨磨性、耐耐化学腐腐蚀性、可生物物降解等等良好性性能，从从而被广广泛研究究试图应应用于人人工关节节、人工工血管、药物缓缓释体系系等生物物医学领领域。本本实验试试图用PPVA聚聚合物来来改善丝丝纤维的的性质。结果表表明，添添加一定定量的PPVA能能提高薄薄膜的强强度，这可能能是因为为PVAA通过分分子中的的羟基与与蛋白质质分子形形成氢键键或其它它共价键键，使分分子间作作用力增增强，所所以抗拉拉强度就就大。PVA的的聚合度度间接体体现其分分子量的的大小，分子量量的不同同可能导导致支架架材料力力学性能能的改变变。本

22、实验验考察两两种聚合合度的PPVA（PVAA-1117和PPVA-1244）对支支架力学学性能的的影响，实验结结果表明明PVAA-1224共混混改性效效果优于于PVAA-1117。这这是因为为PVAA-1224分子子量较高高，分子子主链较较长，其其较长的分子链链与蛋白白分子链链之间的的相互缠缠绕作用用更强，拉力作作用下，它的抗抗拉能力力更强。总之，重重组蛛丝丝蛋白与与高分子子材料PPVA共共混可以以明显改改善重组组蛛丝蛋蛋白多孔孔支架的的力学性性能，且且PVAA的聚合度度越高，对多孔孔支架力力学性能能的改善善越明显显。以NaaCl晶晶体为致致孔剂、乙醇作作变性剂剂制得的的共混多多孔支架架力学性

23、性能较好。志谢感谢谢西安工工程科技技学院姚姚穆院士士对本实实验提供供材料测测试的支支持和帮帮助参考文献献1 焦国豪豪.组织工工程支架架材料研研究进展展.化工中中间体,20007,44:266-299.2DDiettmarr WHH. SScafffollds in tisssuee ennginneerringg boone andd caartiilagge. Bioomatteriialss, 220000, 221: 25229-25443.3 胡蕴玉玉.把握契契机加快快我国组组织工程程学的应应用研究究.中华骨骨科杂志志,20000,220:5517-5199.4 Zhaang YQ. Naaturral sillk ffibrroinn ass a suppporrt ffor enzzymee