核医学放射性标记化合物

1、核医学放射性标记化合物第1页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四 放射性核素标记化合物是化合物分子中某一原子或某些原子被放射性核素原子所取代的化合物，是进行机体微量物质测定和示踪研究重要的分析试剂和示踪剂。要求：引入放射性核素后应该保持化合物原有的理化、生物学性质不变。 定义第2页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四标记物举例3H-TdR，研究细胞增殖；药物、蛋白、核酸的标记示踪研究；细胞标记：如RBC标记，将分离的RBC加入Na2 51CrO4约1850-2775KBq，室温放置30分钟，以生理盐水洗涤，就得51Cr-RBC，可测血容量或研究RBC寿命。第

2、3页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四一、放射性核素来源 主要通过人工核反应，从反应堆和加速器中产生，90%的放射性核素用于医学应用，放射性核素必须经过必要的分离纯化、等放射化学处理，经鉴定放射性核纯度，并测定比活度，才供使用。4第4页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四二、标记化合物的概念：1、对放射性核素的选择：半衰期；射线类型和能量；价格、防护；标记难易程度；同位素标记和非同位素标记。5第5页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四两个概念同位素标记： 选用化合物中原有元素的同位素标记：如14C、3H标记。非同位素标记： 采用非原化合物

3、中所含元素的放射性核素，进行标记，如蛋白质用131I或125I标记。 须严格控制标记方法使生物学行为不改变或改变不大，方可用于示踪。 6第6页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四2、标记位置及命名： 标记化合物命名，通常先指出标记部位再指出标记核素，最后列出化合物名称，三部分中以二短横线相联，如：1-14C-醋酸。定位标记（符号S）1-14C-醋酸 CH314C00H2-14C-醋酸 14CH3COOH二者示踪基团不同，合成路线不同。 7第7页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四准定位标记（符号n）：预测可能在某一位置，但不以能保证。非定位标记 均匀标记（符

4、号 u）： 放射性原子均匀地分布于分子中；每一位置的标记概率相同。 全标记（符号G）： 如同位素交换制备氚标记，既不均匀，又不定位，某一类原子被取代的概率不相同，代表整个分子代谢，比活度高，制备方法多。8第8页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四双标记及多标记： 指在化合物分子的不同部位，引入 一种或二种以上元素的同位素原子或引入一种元素的两种或两种以上的同位素原子。 多标记的特点是：示踪应用时，可在同一机体或离体组织中同时观察两个指标，不仅减少工作量，还可排除和减少由于个体差异引起的误差。9第9页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四3、比活度：每毫摩尔所含

5、放射性活度，mci或ci/mmol应用注意： 1，利用分子量不同的化合物间比活度的比较。 2，当某些化合物分子量不确定时，则以 单位重量所含放射性活度来表示。制备和使用高比活度标记物注意：a、受原料比活度和制备方法的限制； b、比活度越高，制备操作越难； c、比活度高时，氚标记物有辐射自分解。 10第10页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四4、放射化学纯度： 指所需标记物的放射性（特定化学态）占总放射性的百分值，一般要求95%以上。5、标记化合物的不稳定性： 引入放射性原子增加了不稳定因素： 放射性衰变； 辐射自分解； 放射性原子脱落、移位。11第11页，共52页，2022

6、年，5月20日，5点18分，星期四三、制备标记化合物基本方法 由人工核反应制得放射性核素，均为简单的化合物，为制得合适的分析试剂或示踪试剂，需进一步以简单放射性化合物为原料来制备或合成。12第12页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四AX + BXO = AXO + BX如：制备G-3H-河鱼屯毒素 可逆反应，反应速度的快慢与反应条件有关，常以交换半值期作为选择最适反应条件的指标。交换半值期的物理意义：产物的浓度等于交换反应达到平衡时产物浓度的1/2所需时间。 1、同位素交换法13第13页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四一般反应3-5个半值期即可。影响交

7、换反应速率的因素： 温度、酸度、压力，所用溶剂性质，反应的浓度及选用合适的催化剂等。14第14页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四优点： 简便，不需制备前体，无复杂合成步骤； 待标记化合物用量少，（适于标记稀有昂贵的复杂有机物）； 可获较高比活度，放射性核素利用率高。15第15页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四缺点：a、中心原子往往用该法难以标记上，如氚、碘常用于交换标记，而14C标记化合物由于反应条件高，不易用此法制备。b、通常条件下能交换的系统，不一定都能制备标记物。c、仅有几个位置可交换，专一性差。d、原料含杂质也含交接位置，易形成放射性杂质。第

8、16页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四2、化学合成法：（常用14C标记）最主要的方法如 H235SO4 +NaOH-Na35SO4 +H2O 与普通化学反应不同之处：1、选用原料，简单无机物，选料受限。2、选择合成路线，并做冷试验。优点：高比活度，高纯度，而又是定位标记的标记物。17第17页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四 全生物合成或酶促合成。如： 14CO2加入藻类细胞中 产生的蛋白 含有16种标记的AA。3、生物合成法（常用14C）18第18页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四优点： 对某些放射性标记物，特别是一些构造复杂，

9、化学合成难以制备或目前尚不可能制备的有机化合物进行标记的有用手段。标记产品具有生物体内原有的旋光性，特别适合示踪。缺点：生成物复杂，较多分离纯化，放射性原料利用率低，难于标记于特定位置上，标记率偏低。 19第19页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四 利用核反应的反冲能，如14N（n,p）14C等，14C具有反冲能与周围化合物可进行相互作用而形成标记物。如果把核素加速，轰击待标记物也能标记。 优点：可制备复杂化合物。缺点：得率低，较繁杂。4、热原子反冲标记 及加速离子标记20第20页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四氚标记化合物合成（3H）1.3H介绍：，

10、18.6KeV。2.氚的优点：来源丰富、弱-、ARG分辨率高，可观察亚细胞形态，标记简单，得率高、比活度高、T1/2长、易运输、贮存安全。3H同位素交换法：直接将3H气体引入待标记物，是不定位标记。21第21页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四优点：简单、方便。缺点：易标记在不稳定位置上、化学键易断、反应时间较长、比活度低、纯化困难。 3H气曝射交换：将化合物涂于管底，然后抽真空、通入氚气，密封反应。如秋水仙碱、喜树碱的3H标记。22第22页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四该标记方法目前 有三项改进： 微波活化氚气；扩大样品反应截面；加入催化剂，提高比

11、活度。23第23页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四催化交换法标记：将氚化溶液加入催化剂与待标记物进行反应。氚标化学合成法：适合于含前体的化合物，先用氧化剂使之脱氢制成不饱各前体。然后操作如下：前体（如烯烃、炔烃等）+ 氚气氚标化合物催化卤素置换法：氚易在催化条件下与溴、碘原子发生置换反应。氚化金属还原法：定位标记。氚标生物化成法：将氚标化合物经酶促作用，转化为另外一种氚标记化合物。 24第24页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四四、一般实验室常用核素标记 （一）放射性碘标记物的一些概念1、125I的特性： 半衰期适中，商品化，易贮存，处理容易。 类似低

12、能射线，易测量，辐射自分解小，标记物稳定性好。2、 125I蛋白质、多肽的放射性碘标技术：标记部位在络氨酸残基苯环上的氢（氢被碘替代）。25第25页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四影响因素蛋白质分子中络胺酸残基的数量及他们分子中暴露程度。碘化物的用量，反应条件（PH、温度、反应时间）、氧化剂的性质。26第26页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四（二）碘标记方法及分类：1、氯胺-T法： CH-T叫N-氯代对甲苯磺酰胺钠盐，为温和氧化剂。它在水中产生次氯酸，次氯酸可使碘离子变为碘分子125I2, 125I2可心置换酪氨酸残基苯环上的H，而加入偏重亚硫酸钠可

13、中止氧化反应。标记原理第27页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四5微克人生长激素+74MBqNa125I+100微克CH-T反应一分钟，200微克Na2S2O5 终止反应，然后分离纯化即可。举例：28第28页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四本法优点： 效率高，重复性好，试剂价格低易得，是常用碘标法。（注意标记物是混合物）分离方法：透析或凝胶过滤。29第29页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四CH-T标记实验应注意的问题氯胺-T临时配制；氯胺-T用量要适宜，过大免疫活性和生物活性低，反之，标记率低；加入氯胺-T后尽快混匀；反应时间：0

14、-24，1分钟左右；反应终止：偏重亚硫酸钠，约1.5倍CH-T量；反应体积小，使微量蛋白质保持高浓度，保证碘化效应。PH值，根据不同的蛋白决定（7.3-7.8）。30第30页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四2、乳过氧化物酶法： 乳过氧化物酶有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用生成125I2，并标记在蛋白质酪氨酸分子上。本法应该注意：反应条件温和，H2O2只需要极低浓度（110-3 mM）因而通常能保持标记化合物原有的生物活性和免疫活性。 缺点：标记率低，20-40% 31第31页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四3、联接标记法： 先用Na125I和

15、氧化剂（CH-T）碘化 酰化剂3-(对-羟基苯)丙酸-N琥珀亚胺酯（Bolton-Hunter试剂或BH） 再与蛋白质分子中的游离氨基酸相结合引入蛋白质中。32第32页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四优点：避免蛋白质与氧化剂的接触；避免蛋白质与放射性碘的直接接触；防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤；适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。缺点：操作麻烦，二步反应，引入异物，放射性碘利用率受一定影响。33第33页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四4、固相氧化法（ Iodogen） Iodogen 在一定PH及温度范围

16、内使用，在水中溶解度极小。 将Iodogen的二氯甲烷溶液放入反应管中或涂在小破片上，微微加热，使溶剂挥发后，反应管下部或小玻片上就形成Iodogen薄膜，蛋白质碘标记反应就在反应管中进行，或将小波片“悬挂”入加有Na125I的细胞培养液中，可使细胞表面的蛋白碘化。优点：碘化效率高，对标记物的损伤程度小。34第34页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四5、核酸碘标记： 即探针，原理同上。举例：DNA的125I标记技术。操作程序DNA常规提取纯化；DNA加热（70），分为单股DNA；用TLCL3将Na125I氧化产生125I2调PH4.7，125I将取代嘧啶环上第5位的碳原子，

17、形成共价结合的DNA单链。降温，恢复双股DNA得125I-DNA；纯化。第35页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四6、32P、35P、33P的标记： 这三核素主要用于标记核苷酸，而标记蛋白常用125I、3H。36第36页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四五、放射性标记化合物的纯化与鉴定（一）标记做完后需做三件事：1、标记率测定2、分离纯化；3、产品质量鉴定；（二）标记率：放射性核素标到标记物的量占投料总放射性的百分数。37第37页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四常用测定方法：1、纸层析法：混合样品中各组分的性质不同，在固定相上的吸附

18、能力和在流动相中的溶解度不同，因此它们各自的移动速度不同，可在特殊纸片上分离开。常用：比移值Rf表示各组分的移动速度快慢。意义：某标记物的Rf值在相同条件下稳定不变。纸层析（薄板）层析示意图见P90。标记率图见P91Rf = 待测组分到原点的距离I 流动相前沿到原点距离L第38页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四2、薄层层析原理 硅胶或氧化铝（固定相）：根据混合物各组分的吸附力和分配系数不同而分开。 离子交换树脂（固定相）：根据各组分离子电荷的性质和数量不同而分开。 聚酰胺：以各组分氢键吸附能力不同而分开。39第39页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四展

19、开实验注意问题层析纸长度，一般20cm左右，越长分离越好；展开剂要精心设计，选2-3种进行验证。要求：能把混合物很好的分开，用时还要组成简单，粘度小，展开快，展开后易挥发，价格低，易购买。点样斑大小适当。点样斑不能碰到展开剂的液体。层析缸要有盖，减少干扰。分段测量，段的大小要一致；起跑点所在段也要测量。高比活度样品点要加载体，减少吸附。第40页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四避免反复点样，层析纸要自然晾干；最好能用标准样品做对照。各段剂量值必须减本底。标记率计算：P90（三）分离纯化（为什么）？纯化方法凝胶过滤法 分离标记蛋白与无机碘离子交换法分离短肽标记物透 析 法分离

20、标记蛋白与小分子亲和层析法特异性好,保持生物活性ConA吸附法糖蛋白41第41页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四标记化合物主要质量指标（5个）1，放射性核素纯度，2，放化纯度、3，放射性比活度、4，生物活性5，免疫活性及标记位置 放射性核素纯度及其检查 所需放射性核素的活度放射性核素纯度（%）=- % 样品的总放射性活度第42页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四（三） 放化纯度及鉴定： 特定化学形态的放射性活度放化纯度 = - % 样品总放射性活度放化纯度的测定原则： 高效的化学分离与灵敏的放射性测量结合。方法：放射层析法（色谱技术）层析谱放射性测量放

21、射自显影（半定量）分段切取测量（放射性分布曲线）放射性扫描 1 放化纯度%= -% 1+2+3+4+543第43页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四放射性高效液相层析法：特点：分析速度快、分离效率高、适用广。（四） 化学纯度及化学量的测定 如氚标记类固醇作RIA分析试剂，其中的化学杂质会影响标记抗原与抗体的结合，使灵敏度降低，因此须控制化学杂质含量。 冷试验、标记化合物（微量分析）44第44页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四（五）放射性比活度及测定 放射性活度比活度 = - 单位化学量比活度的理论值=N=0.693N/T1/2（理论上有多少原子核就应该

22、有多少次衰变）测定：（1） 直接测定 （2）层析扫描面积计算法第45页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四 注意：标记率测定用混合物点样；放化纯度测定用纯化物点样。标记率= S1+S2+S3 100% S1 若投入待标记物W，且100%成为标记物 比活度= W AY （A为总放射性） 46第46页，共52页，2022年，5月20日，5点18分，星期四（3）自身取代法（将Bq/mg换算为Bq/mol）：分三步进行以标记品、标准品与抗体竞争结合做一条B/F对标准品依次递增的曲线。再做一条标记品与抗体特异结合的无竞争曲线，B/F为纵坐标，标记品cpm依次递增为横坐标。将两条曲线放在同一坐标系，任取一点对应的