中南民族大学药学院化学生物学教研室课件

1、中南民族大学 药学院化学生物学教研室尼龙固定化木瓜蛋白酶化学生物学实验1.实验目的化学生物学实验6学时12学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。中南民族大学 药学院化学生物学教研室2.实验原理化学生物学实验6学时1234酶不与产品混合，制品易于纯化。在大多数情况下，可提高酶的稳定性。提高酶的使用效率，降低生产成本。利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产定义：通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载 体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶。固定化酶的优越性主要表现在：2.实验原理化学生物学实验6学时包埋法共价键结

2、合法交联法酶的固定化方法有：吸附法(物理吸附、离子吸附)12343.实验材料、试剂及仪器化学生物学实验6学时材料(1)尼龙布(86或66)，140目，剪成3 cm3 cm大小的方块(2)吸水纸仪器 (1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱及玻璃器皿中南民族大学 药学院化学生物学教研室3.实验材料、试剂及仪器化学生物学实验6学时 (1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH值7.8

3、) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸缓冲液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，内含 20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。主要试剂4.实验步骤化学生物学实验6学时2、酶活力测定(1)溶液酶活力测定：取0.2 mL酶液，加入2.3 mL激活剂，于 37 下预热10min，加入37预热的1%酪蛋白溶液mL

4、， 准确反应10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL终止 酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他与测定管相同，以8000 r/min的转速离心10 min或 过滤，取其上清液于波长280 nm处测定吸光度。在上述条 件下，每10 min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)。(2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激 活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。4.实验步骤化学生物学实验6学时表1 酶活力测定试剂溶液酶固定化酶残留酶CK12CK12CK12激活剂（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或块）0.20.20.21块1块1块0.20.20.237保温5min37 1%酪蛋白（mL）11111137反应10 min20% TCA (ml)摇匀2222222221%酪蛋白（mL）111过滤5.实验数据处理及计算化学生物学实验6学时活力回收=固定化酶总活力数溶液酶总活力数100%相对活力=固定化酶总活力数(溶液酶总活力数-残留酶活力数)100%6.注意事项尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。固定化酶溶液浓度最好为0.51 m