高效液相色谱 (7)PPT

1、关于高效液相色谱 (7)第一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第一节、概述 一、含义 液相色谱 (LC) ：以溶剂液体为流动相的色谱方法 高效液相色谱（HPLC）： 高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器第二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1. HPLC与经典LC的比较经典LCHPLC固定相颗粒100m,不均匀固定相颗粒BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系第四十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月HPLC方法按流动相和固定相特征分为 正相色谱、反相色谱按分离目的分为 分析型、制备型按分离机理分为 吸附色谱、分配

2、色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱等。第四十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第三节 HPLC方法及原理 一、液-液分配色谱法（LLPC）二、化学键合相色谱法（CBPC）三、液-固吸附色谱法(LSAC)四、离子交换色谱法（IEC）五、离子对色谱法（IPC）六、尺寸排阻色谱法（SEC）七、亲和色谱法（AC） 第四十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月一、液-液分配色谱法（LLPC） 1.固定相强极性固定液：，一氧二丙睛中等极性固定液：聚乙二醇非极性固定液：角鲨烷 要求：流动相不与固定相互溶，流动相与固定相极性差别显著避免固定液流失 2.流动相第四十九张，PPT共九十八页，创作于2

3、022年6月 一、液-液分配色谱法（LLPC）适于各种极性化合物的分离 4. 用途 根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。 3.分离原理缺点：固定液机械涂渍、固定液易流失第五十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月1、反相键合相色谱法（RPBPC） 固定相： 采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等二、化学键合相色谱法（CBPC）流动相： 采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。第五十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月 分离机理疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相硅胶表面的十八烷基“分子毛”较强的疏

4、水特性。二、化学键合相色谱法（CBPC）1、反相键合相色谱法（RPBPC）第五十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月分子中非极性部分疏水烷基 缔合作用，分子保留分子极性部分极性流动相 离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为流动相极性溶剂分离物极性官能团有机物第五十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。 用途 1、反相键合相色谱法（RPBPC） 主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物二、化学键合相色谱法（CBPC）第五十四张，PPT共九十八页，创作于2022年

5、6月固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等） 分离机理：范德华力、诱导力或氢键力用途：多用于分离极性或中等极性化合物2、正相键合相色谱法（NPBPC）二、化学键合相色谱法（CBPC）第五十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月3、离子键合相色谱法 固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、C00H流动相：一般采用缓冲溶液。二、化学键合相色谱法（CBPC）分离原理：与离子交换色谱类同用途：多用于分离离子形化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等第五十六张，PPT共九十八页，

6、创作于2022年6月分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同三、液-固吸附色谱法(LSAC)固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂 硅胶、氧化铝、聚酸胶等。流动相：各种极性的洗脱剂用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。 特别适用于分离异构体第五十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别固定相：基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂四、离子交换色谱法（IEC）流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。第五十八张，PPT共九十八页，创作

7、于2022年6月 离子对AB具有疏水性，被非极性固定相提取 不同待测离子A1，A2与B离子间成对能力不同，形成不同疏水性离子对，从而保留值不同原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B加入到流动相中形成离子对AB，间接改变待测离子保留特性五、离子对色谱法（IPC）如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱第五十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相： 作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 六、尺寸排阻色谱法（SEC）常用流动相四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺

8、和水原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。第六十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相主要适合于水溶性高分子的分离凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相主要适合于脂溶性高分子的分离用途六、尺寸排阻色谱法（SEC）特点：固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长相对分子质量差别必须大于10才能分离第六十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月七、亲和色谱法（AC） 原理：利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力，进行选择性分离固定相：生物专一性配基+载体流动相：一定pH的缓冲液第六十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月具有亲

9、和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留；没有亲和力作用的分子不被保留。用途： 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析第六十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第四节 HPLC分离条件的选择根据van Deemter方程和色谱分离方程式选择分析条件 在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u第六十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月（1）固定相：粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力；改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。第四节 HPLC分离条件的选择第六十五张

10、，PPT共九十八页，创作于2022年6月（2）流动相：低粘度的流动相增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm减少传质阻力（3）流速：最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效常采用比最佳流速高数倍的流速加快分析速度第四节 HPLC分离条件的选择第六十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月（4）柱温：提高柱温降低流动相粘度减少传质阻力分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，一般在室温下进行第四节 HPLC分离条件的选择第六十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第五节 HPLC的建立与应用一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。材料来源

11、、浓度范围组分特性、结构、分子量、溶解性等第六十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月一、建立HPLC分析方法的一般步骤 第六十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月一、建立HPLC分析方法的一般步骤 2、选择合适的分析方法适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）流动相检测器样品预处理第七十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月一、建立HPLC分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化流动相种类与配比梯度温度流速检测波长进样量第七十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月一、建立HPLC分析方法的一般步骤 4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。第七十

12、二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月二、HPLC定性定量分析方法1、定性分析色谱鉴定法：保留时间对照化学鉴定法：利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性色谱-光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法： 色谱光谱联用仪第七十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月二、HPLC定性定量分析方法2、定量分析外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等 不需知道校正因子，但需进样量准确内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法第七十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月1、在食品分析中的应用食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；食品添加剂

13、分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。 2、在环境分析中的应用 多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。三、HPLC的应用第七十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月3、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定三、HPLC的应用第七十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月4、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：合成药物

14、：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等5、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。三、HPLC的应用第七十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月我国药典收载HPLC法项目和数量比较表项目数 量1985版1990版1995版2000版2010版鉴别934150检查1240160含量测定7601173871385第七十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月色谱柱类型品种数C18柱1210个C8柱93个氰基柱21个硅胶柱31个苯基柱9个色谱柱类型品种数氨基柱5个丁基柱3个三甲基硅烷柱2个二羟基丙基硅烷键合硅胶柱1个苯乙烯-二乙烯基柱1个2010版药典二部中色谱

15、柱的使用情况第七十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月缬沙坦a-酸性糖蛋白柱盐酸帕罗西汀瑞格列奈手性色谱柱1酸性蛋白柱瑞格列奈片苯磺酸顺阿曲库铵手性色谱柱chiralcel OD-RH注射用苯磺酸顺阿曲库铵甲氨蝶呤牛血清白蛋白键合硅胶柱甲氨蝶呤片注射用甲氨蝶呤第八十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第八十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第八十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第八十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月第六节毛细管电泳法Capillary Electrophoresis第八十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月一、含义电泳：在

16、电场作用下，电解质溶液中的带电质点向电荷相反的电极方向迁移的过程。毛细管电泳：在毛细管中进行的电泳。第八十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月电泳：带电粒子在电场作用下迁移电渗：溶剂在电场作用下的单向流动正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力负溶质离子所受的力：电场力 电渗力中性分子所受的力：电渗力二、基本原理第八十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月 电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，混合物中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。 流出顺序：正离子中性粒子负离子第八十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE）胶束电动毛细管色谱（

17、MECC） 毛细管离子分析 三、分类第八十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月1、毛细管区带电泳 CZE带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出中性粒子：无电泳，受电渗流影响，在阳离子后流出最基本、应用广的分离模式 阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出第八十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月2、毛细管凝胶电泳 CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等采用CGE能获得良

18、好分离，DNA排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。第九十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月 （1）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） 在电场力的作用下，胶束在柱中移动。 （2）电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；第九十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月 （5）色谱与电泳分离模式的结合。 （3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； （4）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；第九十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月加电渗流改性剂使电渗流反向，用于淌度很大的离子的分离，主要是无机阴离子的分离。负高压 。加阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵电渗流XXXXX（）高压（