DB12-T358-2008爱德华氏菌病诊断规程

1、ICS65.150B50 备案号：DB12DB12/T 3582008爱德华氏菌病诊断规程Standard method for diagnosing Edwardsiellosis in fish2008-02-19发布2008-03-30 实施天蓮市质量技术监督局发布DB12/T 3582008本标准的编写以GB/T 1.1 -2000的编制耍求为指南。本标准的附录A、B、C、D为规范性附录。本标准由大津市水产局哗出。本标准起草单位：犬津市水产研究所本标准主笔起草人：冯亍明、李军、 本标准T2Q08年 月首汶发布。王菁、杨凯、马文婷、干.玉佩。爱德华氏菌病诊断规程1范围本标准规定 和结果判

2、定。本标准适用类（包括：亲鱼、成鱼和鱼苗）的该病诊断。了鱼类爱徳华氏歯病诊断规程的诊断方法及所需的仪器、试剂、材料、设备、操作步骤丁天津地区养殖及门然鱼类爱德华氏菌病诊断，也适用丁天津地区与其它地区间流通鱼2规范性引用殳件卜.列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包插勘误的内容） 是否可使用这乌文件的最新阪本。凡是不注日期的引用文件，其最浙版本适用丁本标准。GB/T4789.GB/T 4789.GB/T 4789.GB 6682-GB/T 15805.1-1995 淡GB/T 18088-2000 出入水产动物病害学战土斌主编，北京：中

3、国农业出版社，2004,第一版伯杰细菌鉴定手册或修订版均不适用丁本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的务方研究7-2003食哋卫生微生物学检验副溶血.性弧菌检验28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂30-2003 食1992分析实4品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏歯检验 !佥室用水规格和试验方法水鱼类检疫方法第一部分、境动物检疫采样第8版，北京：北京科学出版社，19883仪器、试剂部材料3. 1设备和仪器生物显微锐（貝油镜利H 水生动物检疫厉用的常规仪希和设备。3.2培养基和若非注明，3.3实验室用按照GB/T音视野）、超净作台、恒温干燥箱、恒温培养箱、培养皿和接种环，以

4、及式剂本标准使用的认为分析纯的试剂，培养基和试剂的配制方法见附录A （规范性附录）。 水5682-1992标准的规定执行。4操作步骤4.1采样按GB仃18 的个体。4.2临床病理4.2.1外部症388 2000标;隹的规定执行。对有症状的鱼类进行采样，挑取不少丁尾症状明显的濒死观察 状观察按照水产动物病害学的方法进行操作。将待检鱼放到白色解剖盘中，仔细观察鱼体表、鳍、眼 睛、口及鲤等， 4.2.2内部解记录症状。剖观察DB12/T 35820082按照 GB/T 15805.1-1995开腹腔，剥离I 形成，记录观纯化及鉴定前剪成弧形，打 观察是否有腹水4.3病原分萬、4. 3. 1病原分鶴按

5、照 GB/T 15805.1-1995标准的规定进行操作。用剪刀从肛门处向前剪开腹部，然后沿背部从后至 内脏各器官，仔细观察鱼的肝、胆、脾、肠、肾筈器官的颜色、质地，并 !察结果。盘中，用75%酒用灼烧炙热的斛标准的规定进行操作。在超净.作台中，将鱼放到用75%酒精消毒的解剖 体表，按照4.2.2的方法打开腹腔，露出肾脏，酒精棉球擦拭肾脏表面后，精棉球擦拭鱼剖刀灼烫肾表面，使肾脏出现白色灼面，将接种环从灼面处刺入肾脏挑取少许肾组织, 在SS琼脂培养基上划线接种。4. 3.2纯化培梟倒置SS琼脂培养基平皿，周边透明的露滴状。将该形咨歯落转接到普通琼脂培养基平板上进一步分离纯化培养，其在普通琼脂培

6、 养基上会形成较小的灰冃色、4.3.3病原菌招态观察4. 3. 3. 1菌体拦动性观察按照GB/T789.30-200,标准的规定进行操作。在灭閩的载玻片上加一滴无歯水，接种环挑取待检 菌苔少许，涂抹在水滴中，力4. 3. 3. 2菌体段色特性与形按照GB/T I4789.7-2003 检歯苔少许涂九，干燥后他nin,水洗，“山脱色液脱色至酒精刚不出现蓝紫色为出，然后用【V液染1 mi倍观察染色特主化鉴定酶试验200。标准的规定进行操作。用灭歯的接种环挑取分离纯化的待检鹵涂丁氧化酶 纸片上，15 s后观察结果。发酵试验 O-F）试验2003标准的规定进行操作。将纯化的待检菌接种到O-F生化管中

7、，加灭由的液监笆恒温培养24 h后，爱徳华氏菌在SS琼脂培养基上的典塑閑落旱中央黑、有光泽的圆形菌落。用II染液染色1 光学显微镜4004. 3. 4病原菌4. 3. 4. 1 氧化按照GB/T口灭歯的盖玻片用400倍的暗视野显微镜观察菌体运动形态。态观察标准的规定进行操作。在灭歯的载玻片上加一滴无菌水，用接种环挑取待 焰上通过3次4次热固定，滴加革兰氏染液，用I染液染色Imin,水洗， 水洗。min,性和形态。4. 3. 4. 2 氧化按照GB/T体孔蜡覆盖培*基液面，然后将生化管置无歯培养皿内，35C培养24 h48 h后观察结果。4. 3. 4. 3 肠杆按照伯素细歯鉴定手册第8版进行。

8、用灭歯的接种环挑取普通琼脂培养基上28C培养18 h24 h的歯苔少许，枸椽酸盐、尿奉、半固体、和萄糖产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉于糖、山梨醇、侧金盏花韓、木胶糖中， 进行15项生化京应。生化试验函件为：产气曲验在三糖铁斜面培养基上观察；赖氨酸、鸟氨酸生化管及对照管中加入灭 鹵液体石蜡覆*培养基液面 养18 h24 h后，向苯丙氨庫生化管中加入苯丙氨酸试剂后立即观察结果，向蛋冃月东水生化管中加入靛 基质试剂1滴S滴，轻轻摇気并观察结果；35C培养24h48h后，向葡萄糖酸盐生化管中加入葡萄糖 酸盐试剂1滴，min 20 min后将全部反，的相应编码，鉴定管使用说菌科细菌生巾编码鉴定管（GYZ-15

9、e）生化试验分别加入生化鉴定管，包括：硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白腺水、葡磷腺水、石蜡高约0.5 cm,然后置灭鹵平皿内，35C培养18 h后观察结果；35C培煮沸中水育3观察结果。应结果记录在 得到一个5位*字 明，并严格按min后观察结果；向葡磷月东水生化管中加入MR试剂1滴2滴，置35C培养10鉴定单上见附录B （规范性附录），并按照所示的方法记取由反应结果得出 ，査检索编码表，便可得到鉴定结果。使用前应详细阅读细歯生化微量 要求操作。5结果判定DB12/T 35820085. 1临床病理观察结果判定5. 1. 1外部症状观察结果判言 爱德华氏関出血、肛门红肿要外部症状为：腹部膨胀

10、，有的病鱼眼球冃浊或突起，体表有不同程度的 :部及两侧发生大面积溃疡。病患病鱼的主,严重的鱼腹5. 1.2内部解剖观察结果判月病患病鱼的土耍内部症状为：肝、脾、肾一般表现为不同程度的肿胀、退色，尤以肾肿 的病鱼胆囊肿大，肠道发炎；多数病鱼有腹水，腹水F.无色或淡黄色胶水状。爱徳华氏鹵大最为严重；有 5.2病原菌形态观察结果判戸病原歯形态观察结果判总依据附录C（规范性附录）。5. 3病原菌生化鉴定结果判定5. 3. 1氧化酶*验结果判定氧化酶试验阳性为紫红色，阴性为无色或淡黄色。肠杆曲科的细歯应为氧化酮阴性。肠杆閔科的细歯应为发酵型代谢。为发酵型细菌，否则不是。5.3.2氧化一发酵试验（O-F）

11、试验结果判定 如O-F生化管变黄色，则5. 3.3肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（GYZ-15e）生化试验结果判定 病原歯生化试验结果判定依据附录D（规范性附录）。5.4综合判定采用本标准诊断方法同时获得5.1、5.2、5.3二条所规定的全部诊断结果，可确诊为爱徳华氏菌病。DB12/T 3582008 A. 1 SS琼脂培养基:制东 牛肉粉 乳糖 硫代硫酸铀 二号胆盐 枸椽酸铀j 枸椽酸铁 琼脂粉 中性红 煌绿 蒸馋水PH混匀后加別煮沸溶解,5g5g10g8.5 g8.5 g8-5 g1.0 g15g0.025 g0.00033 g1000 ml7.0A.2革蓝氏染液:附录A（规范性附录）试剂配制

12、待培养基稍凉后倾注灭歯平皿，凝固后备用。（也可百接购置商品）1、结品紫酒精饱利液2d ml, 1%草酸饺水溶液80 ml混合;碘化钾2 g溶解在300 ml蒸馅水中; 精（医用）；II、碘 1 g、III、95%酒IV、2.5%汁黄酒精溶液10 ml,加蒸馅水90 ml。A. 3生化鉴定试剂按照GB/T 4789.28-2003执行。附录B（规范性附录）肠杆甘科细菌生化编码鉴定管（GYZ-15e系统）鉴定单表B. 1试验硫化氢苯 丙 氨 酸葡 萄 糖 酸 盐东葡 磷 月东 水枸 椽 酸 盐尿素K 1古1 体葡 萄 糖 产 气赖氨酸氨酸棉于糖山 梨 醇侧 金 盏 花木胶糖结果单值421421421421421总值注：1、结身2、单隹3、总隹,按反应的结5,将町性反倒,依生化反应G1分为阴性“一”和阳性“ + ” Oj 划 1:0。:;的回性数值，单值累加并列1.一起。附录C（规范性附录）迟缓爱德华氏菌的判定表C. 1名称创菌在SS琼脂培养基上閑落 开，态菌体运动情况革蓝氏染色迟缓爱徳4:氏曲#央黑，周边透明的露滴状 ，落菌体为短杆状，周毛南，可运 动，歯体人小为0.5卩ml卩m X 1 卩 m 3（im。阴性DB