DB12-T179-2003嗜水气单胞菌出血性败血症检疫规程

1、ICS65.105ICS65.105B50 备案号：DB天 津 市 地 方 标 准DB12/T 1792003嗜水气单胞菌出血性败血症检疫规程The Quarantime Instruction for Hemorrhagic Septicemiafrom Aeromonas hydrophile2003-11-25 发布2004-01-01 2003-11-25 发布天津市技术监督局发布DB12/T 1792003DB12/T 1792003本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由天津市水产局提出。本标准由天津市水产局归口。本标准起草单位：天津市水产研究所本标准主要起草人：李秀梅、赵燕超

2、、乔之怡 本标准于2003年11月首次发布。嗜水气单胞菌出血性败血症检疫规程1范围本标准规定了嗜水气单胞菌出血性败血症的检疫规程。本标准适用于天津地区鱼类检疫，也适用于我国国内地区间鱼类的检疫、诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4789. 128食品卫生检验方法微生物学部分GB/T 6682-1992分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088

3、2000出入境动物检疫釆样3准备3.1设备和仪器3.2设备和仪器见附录A。3.3培养基和试剂培养基和试剂的配制方法见附录B。4釆样4.1釆样数量对无症状的鱼类，按GB/T 18088-2000的规定执行。对有症状的鱼类，随机挑取不少于10尾有发 病症状的新鲜或濒死的个体。4. 2釆集部位怀疑有病原存在的组织或器官。5实验室用水要求按照GB/T 6682-1992中的规定执行。6临床症状6.1外部症状病鱼体发黑、鳍基部充血，体两侧点状或块状出血，鱼的吻端、上下颌、口腔、觸盖、眼底、眼眶 周围严重充血。6.2剖检腹腔内积存淡黄色透明液体或血水混杂液，肝胰脏、脾脏、肾脏肿大，脾脏紫黑色，肾脏松弛，严

4、 重的有积水，胆囊肿大，色异常；腹膜、肠壁及肠系膜充血，肠内无食物，粘液多或积水或内充气体, 頤壁充血，发病鱼严重贫血。DB12/T 1792003DB12/T 1792003227实验室检验7.1取样可用锥子或解剖针刺穿头骨，破坏小脑，使鱼失去运动能力，然后用75%酒精棉球擦净被检鱼体表， 在肛门前面0. 5cm处用无菌剪刀向前剪开腹部，然后从原下剪处沿一侧向背部逐步转向头部剪成弧形， 打开腹腔，露出肾脏。用接种环无菌操作，从肾脏取组织块放在TCBS培养基上，轻压组织块后，在培养 皿上划线接种，进行分离培养。7.2培养倒置TCBS培养基，37C恒温培养24h左右后，分别挑选不同颜色、大小和形

5、状的单个菌落，再转 接到普通琼脂平板培养基上进一步分离纯化培养。嗜水气单胞菌在TCBS培养基上长出的典型菌落为黄 色菌落。其在普通琼脂平板培养基上进行培养时会形成边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃 红色，有光泽的圆形菌落。7.3取待检菌作下列検验7.3.1菌体运动性观察选厚薄在1.11.2mm的干净载玻片一块，加一滴无菌水至载玻片上，用接种环挑取待检菌菌苔少 许，涂抹在水滴中，加盖玻片用400-600倍的暗视野显微镜观察菌体是否运动。7.3.2菌体染色特性与形态观察取干净载玻片一块，滴12滴无菌水，用接种环挑取待检菌菌苔少许涂片，干燥后在火焰上通过三 次固定，滴加革兰氏染液，I液染li

6、nin, II液染2min, III液脱色至酒精刚不出现蓝紫色为止，IV液染1 2min0用油镜观察染色特性和形态。7.3.3氧化酶试验用灭菌接种环挑取普通琼脂平板上分离纯化培养的待检菌涂于氧化酶纸片上或直接用纸片沾取菌 落，1020秒钟观察结果，阳性为紫红色，阴性为无色或淡黄色。弧菌科的细菌应为氧化酶阳性，但弧 菌属中的梅氏弧菌例外，为氧化酶阴性，须予以区别对待。7. 3.4氧化-发酵试验即（O-F）试验将被检菌接种到0-F生化管中，并加灭菌液体石蜡覆盖培养基液面，约加1cm,然后置灭菌平皿内， 35C培养2448h后观察结果。如。-F生化管变黄色，则为发酵型细菌。弧菌科的细菌应为发酵型代谢

7、。 7.3.5用弧菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-9V进行检验用接种环挑取在普通琼脂平板上28C培养1824h的菌苔少许，分别加入生化鉴定管:赖氨酸、精 氨酸、鸟氨酸、葡萄糖产气、蔗糖、甘露醇、水杨昔、6%氯化钠、枸橡酸盐中，进行九项生化反应。其 中赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和氨基酸空白对照管都应加入灭菌液体石蜡覆盖培养基液面，约加0.5cm, 然后置灭菌平皿内，经35C过夜孵育后，将反应结果记录在如下的鉴定单上，见表1,并按照所示的方 法记取由反应结果得出的相应编码，得到一个三位数字，查检索编码表，便可得到鉴定结果。使用前应 详细阅读使用说明，并严格按要求操作。DB12/T 1792003DB12

8、/T 1792003 表1弧菌科细菌生化编码鉴定管（GYZ-9V系统）鉴定单试 验赖 氨 酸精 氨 酸鸟 氨 酸葡萄 糖产 气庶爐甘 露 醇水 杨 昔6% 氯 化 钠枸酸盐结果单值421421421总值注：1、结果，按反应的结果分为阴性和阳性“+”。2、单值，将阳性反应的划上O。3、总值，依生化反应管的阳性数值，单值累加并列在一起。8判定8.1嗜水气单胞菌的判定见表2。表2嗜水气单胞菌的判定名称细菌在TCBS培养 基上的菌落颜色菌落形态 光泽菌体运动情况革蓝氏染色生化管反应结果嗜水气单胞菌黄色正圆隆起 周缘光滑 有光泽 半透明极端单鞭毛，可 运动，菌体为短 杆状，菌体大小 为 0. 5 0.6

9、 u mX 1.01. 8 u mo阴性依据得到的相应编 码查检索编码表8.2临床检查发现体表、鳍条、体测、头部、口腔均明显充血，突眼、肛门红肿、内脏多发性出血, 脾肿大，检出肾脏有嗜水气单胞菌，即可判定为嗜水气单胞菌出血性败血症。附录A（资料性附录）设备和仪器生物显微镜（具油镜和暗视野）、超净工作台、恒温干燥箱、恒温培养箱、培养皿和接种环，以及 水生动物检疫所用的常规仪器和设备。附录B（资料性附录）试剂配制B. 1硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂（TCBS）培养基： TOC o 1-5 h z 酵母浸膏5. 0g蛋白腺10.0g氯化钠10.0g柠檬酸钠10. 0g胆酸钠（牛胆酸钠也可）3. 0g牛胆代粉（混合胆盐代替也可）5.0g蔗糖20.0g柠檬酸铁l.Og琼脂18.0g漠麝香草酚蓝0. 04g麝香草酚蓝0.04g蒸馋水1000ml除指示剂外,将各种成分加热溶解，调整pH至8. 6后，加入指示剂。此培养基不必高压灭菌，煮沸12min,待培养基稍凉后倾注平板。（可直接购置商品）B.2革蓝氏