羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化

1、羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反响体系的正交优化 古松蒋舜媛唐学芳孙辉杨志荣孙群【摘要】目的通过讨论羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响，以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增ISSR-PR最正确反响体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PR反响体系的4因素g2+，dNTP，引物，Taq酶在3个程度上进展优化实验，PR结果用SPSS13.0统计软件分析，并设置梯度PR进展引物退火温度筛眩结果在20lISSR-PR反响体系中，各组分的最适浓度为：2.0l/Lg2+，250l/LdNTPs，0.50l/L引物，1UTaq酶，40ngDNA模板；模板DNA40

2、90ng，不同引物有不同的最正确退火温度，范围在4852。结论该优化体系的建立为进一步进展羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。【关键词】羌活宽叶羌活简单重复序列区间扩增正交实验设计Keyrds:Ntpterygiuinisu;N.frbesii;ISSR-PR;rthgnaldesign1材料与方法1.1材料1.2试剂与仪器ISSR引物采用加拿大大不列颠哥伦比亚大学UniversityfBritishlubia提供的引物序列set#9，N.801-900，经挑选以UB827，即(A)8G作为此次正交实验的固定引物，由北京赛百胜基因技术合成；100bpDNALadder购自Ferent

3、as；DL2000购自清华天为时代；dNTP、TaqDNA聚合酶购自大连宝生物；琼脂糖为Siga公司产品，其它试剂为国产分析纯。PR反响在美国J公司的PT-200型PR循环仪上进展。DNA浓度和纯度测定使用英国Bihr公司消费的GeneQuantPr核酸检测仪。1.3DNA的提取和测定参照邹喻萍等9改良TAB稍加改动，提取其DNA，用核酸检测仪测定所提DNA的浓度和纯度，并在0.8%琼脂糖凝胶上通过电泳检测其是否降解，然后稀释成30ng/l，备用。1.4PR反响体系的正交实验采用L9(34)正交实验设计10，结合预实验的结果，由g2+,dNTP,引物和Taq酶4因素各3程度组成。见表1。表1I

4、SSR-PR正交实验设计表L9(略)以上9个组合，每个处理2次重复，按表1加样。反响体系总体积为20l，引物为UB827(A)8G。除上述变化因素外，每管还包括1PRbuffer，40ng模板DNA。反响程序为：94预变性5in；94变性30s，50退火45s，72延伸2in，循环35次；72延伸5in；4保温，终止反响。PR产物用1.2%琼脂糖凝胶于不超过5V/的电压下电泳，电极缓冲液为1TAE或0.5TBE，在含有0.5gl-1EB中染色30in，凝胶成像系统拍照记录和分析。结果用SPSS13.0统计软件进展分析，得到ISSR-PR反响各因素的最正确程度。1.5退火温度的梯度挑选根据正交实

5、验挑选出的最正确反响体系，对经初筛出的引物进展退火温度梯度挑选，根据理论退火温度，设定在46.060.0之间，扩增仪自动生成12个温度梯度：46.0，46.4，47.2，49.9，52.0，54.3，56.3，57.8，59.7，60.0，根据电泳结果挑选出各引物的最正确退火温度。2结果与分析2.1正交实验结果及分析dNTP作为PR反响原料，量太少会使扩增反响进展不完全；量过多，那么会对g2+产生拮抗作用，且造成不必要的浪费。多重比较显示图2b本实验所选梯度范围dNTP对PR反响结果均值随其浓度增加呈缓慢上升趋势，以2.50lL-1最正确。g2+主要是通过改变聚合酶的活性对PR反响结果产生影响

6、，本实验各浓度程度对结果的影响有一定差异，表现为1.52.0lL-1范围内，反响结果均值随g2+浓度平均值递增，但差异不显著，二者与2.5lL-1程度间差异显著图2a，本文确定g2+浓度为2.0lL-1。引物浓度的0.25，0.50lL-1和0.75lL-1程度间差异显著，说明引物浓度程度变化对PR产物电泳是影响ISSR扩增的一个重要因素，引物浓度过高易引起碱基错配和产生非特异性扩增，还易形成引物二聚体；引物浓度过低，其与DNA模板结合位点少，扩增产量下降，且扩增结果不稳定如图1中1，6，8号处理所示。本实验中引物浓度定为0.50lL-1，将此浓度用于不同引物的扩增均获得良好效果图2。Taq酶

7、对PR反响的影响在所选梯度范围呈正相关，即随着Taq酶量增加，结果均值呈上升趋势图2d，但对本实验结果的影响相对较校根据对羌活和宽叶羌活样品数据分别分析，并结合对Taq酶单独进展梯度实验验证，1.0U表现最为稳定，故在20l体系里选择1.0U为最正确反响程度。2.2不同退火温度对ISSR-PR扩增的影响PR反响中，退火温度直接影响引物与模板的特异性结合13，根据正交实验设计的结果,选择2号处理进展退火温度的梯度挑选实验，在JResearhPT-200扩增仪上自动生成12个温度，进展温度梯度比较，结果见图3说明，退火温度过低那么扩增特异性差，背景深；退火温度过高，那么引物与模板结合差，PR产物丰

8、度低，电泳条带亮度校并且引物不同，其所需的最适退火温度区间也有差异。对其它引物进展梯度PR扩增亦得到了相似结果，由于ISSR引物较长，可相对进步ISSR反响的退火温度，以进步反响的准确性和稳定性。图3显示，UB835的适宜退火温度是48，而UB864的最适退火温度为52左右。3讨论由于ISSR分子标记技术基于PR反响，其扩增谱带虽较RAPD标记稳定，但同样受反响条件和扩增程序变化以及物种不同的影响9。有的研究认为Taq酶的浓度变化影响最大12，有的认为PR对g2+最为敏感14，有的研究结果显示dNTP影响最大15，可能由于实验材料的不同及反响各因素的综合作用等原因导致本实验结论有所不同。正交实

9、验法用于PR反响条件优化已见诸报道11，12，14，15，虽然实验结果的定量判断根据带有一定主观性和个体差异，不能很好地估计实验误差等局限性，但此法能通过较少量的实验，较快找到影响反响条件的主要因素的较为优化的程度组合，防止了单一因素实验结果的缺乏，不失为一种快捷、高效的实验挑选方法。本实验同时对羌活属两种植物样品开展正交挑选，优化组合结果显示出较高的一致性，结合单因素实验验证确定了最优组合，将为下一步开展羌活遗传多样性等研究打下了良好的基矗4结论本实验利用正交实验设计方法，初步建立并优化了羌活和宽叶羌活ISSR标记的PR反响体系。这一反响体系受诸多因素的影响，包括g2+浓度，dNTPs，引物，Taq酶、和DNA模板等各反响成分都会影响PR产物的生成和质量。采用两种分析方法对4因素g2+，dNTPs，引物，Taq酶3程度的正交实验结果进展分析比较，得到相似结果，均显示在本实验所设置的因素程度范围内，引物浓度对PR实验结果影响最大，且不同程度间差异极显著，而dNTPs影响较校本实验研究还说明，对羌活和