毒理学基础实验指导

1、卫生毒理学实验指导编写：陈秉符古雅2009年3月目录TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark2 实验一毒理学实验设计1 HYPERLINK l bookmark12 实验二实验动物的一般操作技术10 HYPERLINK l bookmark24 实验三灭多威经口急性毒性试验20 HYPERLINK l bookmark54 实验四苯经呼吸道急性毒性试验24 HYPERLINK l bookmark70 实验五蓄积毒性试验27 HYPERLINK l bookmark76 实验六亚慢性和慢性毒性试验29 HYPERLINK l bookmark96 实验七小鼠骨髓细胞

2、微核试验33 HYPERLINK l bookmark110 实验八小鼠精子畸形试验37 HYPERLINK l bookmark128 实验九骨髓细胞染色体畸变分析40 HYPERLINK l bookmark136 实验十鼠伤寒沙门菌回复突变试验42 HYPERLINK l bookmark152 实验十一致畸试验及胚胎胎仔检查方法47 HYPERLINK l bookmark164 实验十二网织红细胞计数53 HYPERLINK l bookmark178 附录：动物实验报告的撰写及注意事项54 五、结果分析与评价本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。六

3、、注意事项该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。熟悉各种骨髓细胞并能进行正确区分。实验八小鼠精子畸形试验一、目的和意义小鼠精子畸形试验为评价环境化学物质对生殖细胞遗传损伤提供了一个简易、方便的方法。多种化学致突变原能引起精子的形态异常。因此精子畸形试验也是对一组评价遗传损伤试验方法的补充。用二种以上的动物（小鼠及9种其它哺乳动物）对24种化学品进行精子畸形试验证明，不同动物之间和人的试验结果，有着很大的相似性。这就有可能用小鼠试验结果来预测化学物质对人类精子的遗传危害。从而提高了此方法的实用价值。虽然精子形态检查的终点并不是用来直接衡量遗传学损伤，但是对评价化学物质的危险度（ris

4、k）是有价值的。理由是：一个化学物能诱导精子形态变化就是有利的证据，表明它能干扰精子正常生成与成熟；有些能引起遗传性精子损伤的化学物质亦能引起精子头部畸形；化学物引起小鼠精子头部损伤与它引起生殖细胞突变能力的高度有关。这些情况表明小鼠精子形态试验结果阳性的化学物应该被认为是哺乳动物生殖细胞的潜在诱变剂。通过本次实验，掌握小鼠精子畸形试验的操作方法二、原理精子畸形包括形状改变及精子畸形数量的增加。引起精子畸形的机制尚未最后阐明，Wyrobek认为，可能是诱变剂使精子形成有关的基因发生突变而引起。Krzanowska认为：y-性连锁基因控制畸变精子的数量，常染色体基因控制精子的表现型，因此当环境化

5、学物质使上述基因发生突变时，就会导致精子畸形或畸形率增高。某些特异的染色体重排，如：性-常染色体易位，也可使精子发生畸形。各种诱变剂作用于精子的不同发育阶段，可在接触该诱变剂后不同时间出现精子畸形。一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期（精原干细胞一初级精母细胞一次级精母细胞一精细胞一精子）的生殖细胞对化学诱变剂较为敏感，故一般在接触诱变剂后第四周最易出现精子畸形或畸形率增高。三、试剂与器材药物及试剂1环磷酰胺：以灭菌生理盐水配成4mg/ml2甲醇：化学纯，固定用32.5%伊红染液主要器材显微镜、天平（感量O.lg）、解剖板、手术剪、眼科小剪刀、弯头眼科小镊子、滤纸、擦镜纸、小试管、小漏斗、3

6、0mm培养皿、带乳头滴管、载玻片、1ml注射器、试管架、染色缸、晾片架四、操作步骤1动物选择选择体重2535g性成熟的昆明雄性小鼠。2给药方法腹腔注射。3染毒次数及取样时间环磷酰胺剂量40mg/kg进行腹腔注射，注射量为0.1mg/10g,连续五次给药（有报告认为，连续五次给药更具有重现性）。即每天染毒一次，第6天取样（染毒操作由实验教师完成）。4制片染毒的第6天颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹腔，摘取双侧附睾，放入盛有约1毫升生理盐水的小培养皿内。用眼科小镊子把附睾剪碎。用四层擦镜纸，放在小漏斗上进行过滤，滤液放入试管内。加入2.5%伊红染液2滴，用毛细滴管轻轻（柔和）吹打10次。吸取12滴含精子和

7、伊红染液的生理盐水置载玻片上，用滴管平推制片，凉干。在染缸内用甲醇固定2次，每次2分钟，凉干后用自来水轻冲涂片正反两面,再次晾干后镜检。5镜检在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿色滤光片。每只小鼠检查完整的精子100条。精子畸形主要表现在头部，可分为：无钩、无定形、香蕉形、尾折形、胖头、尾折叠、双头及双尾等形态。注意：镜检时，要注意区分两条精子部分重叠所造成的假双头和假双尾精子。头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行计数。面图片为精子结构图（图8-1）和部分实验动物的精子形态图（图8-2）线粒体鞘尾鞘9对内纤丝2条中心纤丝核子后帽近端中心小体头部颈部f中段主段轴丝细胞质膜顶脊线粒体鞘尾鞘9

8、对内纤丝2条中心纤丝核子后帽近端中心小体头部颈部f中段主段轴丝细胞质膜顶脊核尾部9条粗外H纤丝9对内纤丝、2条中心纤丝一线粒体末段图8-1精子的结构图末段图8-1精子的结构A.鸡D.小鼠B.大鼠C.地鼠B.大鼠C.地鼠E.豚鼠精子畸形主要表现在头部，可分为：无钩、无定形、香蕉形、尾折形、双头及双尾等。判断双头双尾时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别。无尾精子、头部重叠或整个精子重叠的均不计数。除记录下畸形精子数外，还要分别记录下各种类型畸形的精子数，进行畸形类型的构成比分析。评价精子畸形阳性的标准是：畸变率至少为阴性对照值得倍量或将每一给药组的结果与阴性对照组比较用非参数等秩和检验方法统计处理

9、有显著差异。精子畸形试验可以作为毒性试验的量性生殖毒性的终点，但它的用途通常仅限于那些具有明显生殖细胞毒性的化学物，因此，当化学物具有很轻微的作用时，其终点观察的意义是有限的。据已知的资料统计：精子畸形试验阳性的化学物是致癌原特异性为2/2（100%）；受试的全部已知致癌原中只有43%在精子畸形试验为阳性，采用致死剂量也只有54%阳性灵敏度为20/64（43%和54%）；非致癌原在精子试验中百分百阴性。这些提示阳性结果对评价化学物潜在致癌性有一定的价值，但阴性结果（达到致死剂量时）的意义还不清楚。六、正常值正常小鼠精子畸变率为1.3%七、附录附表精子畸形试验分析记录受试物名称剂量mg/kg动物

10、种类标本号制片日期.镜检日期片盒中位号镜检者检查精子总数畸形精子记录形态组别无钩香蕉形无定形胖头尾折叠双头双尾其它八注意事项1镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾及双尾畸形等假象。实验九骨髓细胞染色体畸变分析一、目的意义所有生物细胞的染色体均有一定的数目和特点的形态结构，而且这些特征是相对恒定的，使生物体各种各样的遗传性状得以世代相传，这就是遗传物质的相对稳定性。若受到某种致突变性物质的作用后，染色体的固有数目和形态发生突变即染色体畸变。分析动物骨髓细胞染色体畸变这个终点可推测人的体细胞的损害，从而预测致癌可能性。染色体畸变分析是

11、一种简便、经济利于推广的细胞遗传学方法。掌握一种体内致突变试验方法和染色体制片技术及染色体方法。二、器材和试剂、主要器材：手术剪刀、普通剪刀、离心机、1ml注射器、5i/2针头、刻度离心管、载玻片、酒精灯、火柴、玻璃蜡笔、20ml量筒、玻片架、干净纱布、青霉素小瓶、止血钳、恒温水浴箱、普通显微镜（带油镜）、擦镜纸、试剂0.04%秋水仙素：用灭菌生理盐水配成0.04%的溶液，置4C冰箱，保存备用。1/15M磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液：称取污水KH2PO4（分析纯）9.06克，溶于1升重蒸馏水中。1/15M磷酸二氢钠（Na2HPO4）溶液：称取无水Na2HPO4（分析纯）9.45克溶于1升重蒸

12、馏水中。pH6.8磷酸盐缓冲液：取1/15M磷酸二氢钾溶液50.4ml及1/15M磷酸氢二钠溶液49.6ml混合。0.075MKCI溶液。甲醇-冰醋酸固定液：冰醋酸（分析纯）和甲醇（分析纯）以1：3混合，临用前配制，储存时间不超过1小时。7吉姆萨染液（Giemsa）：称取3.8克吉姆萨染料，用少量醇在玻璃研钵中研细，逐渐加入甲醇至375毫升，待完全溶解后加入125毫升纯甘油，于37C保温48小时，其间摇动数次。保温后放置12周，过滤备用。此为原液。临用时用磷酸盐缓冲液稀释。8二甲苯（分析纯）三、操作步骤、动物处理常用健康成年大鼠或小鼠，一般设23个不同剂量组。剂量为1/4、1/8和1/16LD

13、50；也可设最大无剂量为最高剂量组，人的可能摄入量为最低剂量组，中间插入一剂量组。另设银杏对照组和阳性对照组。给药次数：急性畸变试验为一次给药或连续两天，每天一次；亚急性试验为连续五天，每天一次；慢性试验为连续3个月给药。给药途径按实际接触，可采用经口腹腔注射、皮下注射和呼吸道吸入等。、取材动物于末次给药后6小时，于腹腔注入秋水仙素（大鼠1mg/kg，小鼠4mg/kg），注入秋水仙素后24小时处死动物。立即去其二侧肱骨，剔去肌肉，以滤纸或干净纱布去血污，剪去两端骨骺，放入盛有5ml生理盐水的青霉素小瓶中，用止血钳夹碎股骨，用滴管轻轻吹打，使成骨髓细胞悬液，稍等数分钟，上清液倒入10m1刻度离心

14、管内（防止碎骨倒入），以1000转/分离心10分钟，弃上清液。、低渗上面离心管留下的沉渣液中加入0.075MKCI溶液5ml,混匀后置37C恒温水浴箱中低渗1520分钟，加入1ml固定液固定，打匀后以1000转/分离心10分钟，弃上清。、固定在离心管留下的沉渣液中沿管壁加固定液5ml，打匀静置30分钟，以1000转/分离心10分钟，弃上清。、制片离心管的沉淀物中，加入0.30.5ml固定液打成细胞悬液，用镊子从冰水中取出载玻片，吸取混匀的细胞悬液，从35cn处滴45滴在玻片上，细胞悬液可迅速在玻片上自行扩散或轻轻吹气帮助扩散。在室温下自然干燥或酒精灯热吹风（微热）使干。编号。、染色将吉姆萨原液

15、用pH6.8的磷酸缓冲液稀释10倍，染色1020分钟，然后以自来水向有细胞的玻片背面缓缓冲去多余浮色，干燥后镜检。、观片先在低倍镜下观察制片的质量，选择染色体分散良好，又比较集中，各染色体之间互不重叠，长短收缩适中，两条单体分开等适于观察的部位，用油镜惊醒中期相染色体分析。对每只试验动物至少检查100个中期相细胞，每个剂量组不少于500个。染色体分析的主要项目为染色体数目和形体的畸变情况。1染色体数目畸变：多倍体（三倍体以上）及非整倍体。2染色体形态畸变：断裂：染色体或染色单体受损，断开的长度大于染色体宽度，并离开原位。断片：染色体断裂后，断裂部位脱离了染色体而未与着丝点相连。缺失：染色单体臂

16、上缺少1/3以上。碎片：点状或片状染色体物质。微小体：是染色体臂上两个靠的很近的断裂，形成成对的中间小断片，较断片小而呈球形。属中间缺失。无着丝点环有着丝点环双着丝点环裂隙：染色体或染色单体的断裂间隔小于染色体臂的横径，并不离开原位，是染色体轻度损伤，可自行修复。对细胞遗传的意义尚有争论。四、注意事项1了解所有动物正常的染色体形态及自然畸变率。低渗处理是操作关键，时间短，染色体铺展不均，处理时间过长，则会引起细胞破碎，甚至由于染色体膨胀过度而致形态结构模糊，合适的低渗时间与温度有关。固定的次数和时间影响制片质量。固定不足，可引起染色体结构的变化；而固定次数过多又易使细胞丢失，一般固定两次即可。

17、实验十鼠伤寒沙门菌回复突变试验一、目的鼠伤寒沙门菌回复突变试验是遗传毒理学体外试验，遗传学终点是基因突变，用于检测受试物能否引起鼠伤寒沙门菌基因组碱基置换或移码突变。二、原理鼠伤寒沙门菌的突变型（即组氨酸缺陷型）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。致突变物可使沙门菌突变型回复突变为野生型（表现型），因而在无组氨酸培养基上也能生长。故可根据在无组氨酸的培养基上菌落生成数量，检查受试物是否为致突变物。对于间接致突变物，可用经多氯联苯（PCBs）诱导的大鼠肝匀浆制备的S9混合液作为代谢活化系统。三、仪器和试剂低温高速离心机，低温冰箱（一80C）或液氮罐，洁净工作台，恒

18、温培养箱，恒温水浴箱,蒸气压力锅，匀浆器等实验室常用设备。培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限。2培养基制备（1）营养肉汤培养基：牛肉膏2.5g，胰胨（或混合蛋白胨）5.0g,氯化钠2.5g，磷酸氢二钾（KHPO3H0）1.3g，加蒸馏水至500ml。加热溶解，调pH至7.4，分装后0.103MPa20min242灭菌，4C保存备用。（2）营养肉汤琼脂培养基:用作基因型（rfa突变,R因子，pAQl质粒,UvrB）鉴定。琼脂粉1.5g营养肉汤培养基100ml，加热融化后调pH为7.4，0.103MPa20min灭菌。（3）底层培养基1）磷酸盐贮

19、备液（V-B盐贮备液）：磷酸氢钠铵（NaNH4HP04）17.5g，柠檬（CH0H20）10.0g，磷酸氢二钾（KHPO：）50.0g,硫酸镁（MgS07H0）1.0g,加蒸水至100ml，6872420.103MPa20rain灭菌，待其他试剂完全溶解后，再将硫酸镁缓慢放人其中继溶解否则易析出沉淀。2）40%葡萄糖溶液：葡萄糖40.0g,加蒸馏水至100ml,0.055MPa20min灭菌。3）底层培养基（1.5%琼脂培养基）：琼脂粉6.0g,蒸馏水400ml,融化后0.103MPa20min灭菌。趁热（80C）,在灭菌琼脂培养基中（400m1）依次无菌操作加入：磷酸盐贮备液8ml,4%葡萄

20、糖溶液20ml，充分混匀，待凉至60C左右时倒人平皿，每皿（内径90mm）25ml,37C培养过夜以除去水分及检查有无污染。（4）顶层培养基1）顶层琼脂：琼脂粉3.0g，氯化钠2.5g，加蒸馏水至500ml。2）0.5mmol/L组氨酸一生物素溶液（诱变试验用）：D生物素（分子量244）30.5mg,l组氨酸（分子量155）17.4mg,加蒸馏水至250ml。3.鉴定菌株基因型用试剂（1）0.1mol/L组氨酸一0.02mol/LD生物素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）：称取L盐酸组氨酸（MWl91.17）191.7mg,D生物素12.2mg，溶于lOml蒸馏水，0.103MPa20min灭菌，保

21、存于4C冰箱。0.8%氨苄西林溶液(鉴定菌株用，无菌配制)：称取氨苄西林40mg，用0.02mol/L氢氧化钠溶液5ml溶解，保存于4C冰箱。0.8%四环素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)：称取40mg四环素，用0.02mol/L盐酸5ml溶解，保存于4C冰箱。0.1%甲紫溶液(鉴定菌株用)：称取甲紫10mg，溶于10ml蒸馏水。4活化系统的制备大鼠肝S的诱导和制备：选健康雄性成年SD或Wistar大白鼠，体重150g左右，周龄9约56周。将多氯联苯(Aroclorl254)或国产PCB-氯溶于玉米油中，浓度为200mg/kg,腹腔注射，5d后断头处死动物，取出肝脏称重后，用预冷的015molLK

22、Cl溶液冲洗肝脏次每克肝(湿重)加预冷的o.15mol/LKCl溶液3ml，连同烧杯移人冰浴中，用消毒剪刀剪碎脏，用匀浆器(低于4000r/mln，12rain)制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温(0C-4C)高速离心机上，以9000g离心10min。吸出上清液S9组分，分装。最好用液氮或一80C低温保存。S9应经无菌检查，蛋白含量测定(Lowry法)及间接致突变物鉴定其生物活性合格。S混合液的配制90.4mol/LMgC1.65mol/LKCl：称取MgCl26H208.1g，KCl12.3g加蒸馏水稀至100ml，0.103MPa20min灭菌或滤菌。0.2m

23、ol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，每500ml由以下成分组成：磷酸氢二钠(NaHPO2414.2g/500m1)440ml，磷酸二氢钠(NaHP0013.8g/500m1)60ml，调pH至7.4,0.103MPa20min242灭菌或滤菌。10%S9混合液的配制：每10ml由以下成分组成，临用时配制。TOC o 1-5 h z灭菌蒸馏水3.8ml磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH7.4)5.0ml65mol/L氯化钾0.4mol/L氯化镁溶液0.2ml葡萄糖一6磷酸溶液(0.05mol/L)40/pmol辅酶II液(0.05mol/L)50pm01肝S9液1.0ml混匀，置冰浴待用。四、

24、菌株及增菌培养1试验菌株采用四株鼠伤寒沙门突变型菌株叫、叫、TAl00和。叫、巩可测移码型致突变物，TAl00可检测碱基置换型致突变物，TAl02可检出移码突变型和碱基置换致突变物。增菌培养取灭菌的25ml三角烧瓶，加人营养肉汤10ml，从试验菌株母板上刮取少量菌，接种至肉汤中。37C振荡培养10h。存活细菌密度可达(12)X109/m1o五、菌株鉴定和保存4种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反应鉴定合格后才能用于致突变试验。菌株基因型鉴定(1)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验)：取2个底层培养基，其中一个培养基表面涂0.1ml的0.1mol/L组氨酸一0.

25、5mmol/L生物素溶液，另一个仅加0.1ml的0.5mmol/L生物素溶液。将试验菌株在此两组培养基上划线接种，经37C培养2448h，观察生长情况。此种菌株应在补充有组氨酸的培养基上生长，而在无组氨酸的培养基上不能生长。（2）深粗糙型（ifa）鉴定（甲紫抑菌试验）：深粗糙型突变的细菌，缺失脂多糖屏障，因此分量较大的物质能进入菌体。鉴定方法：用移液器吸0.1%甲紫溶液20gl，在肉汤平板表面涂成一条带，待甲紫溶液干后在与甲紫带方向垂直划线接种4种试验菌株。经37C培养2448h,观察生长情况。此4菌株在甲紫溶液渗透区出现抑菌，证明试验菌株有fa突变。（3）uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验）

26、：uvrB缺失即切除修复系统缺失。鉴定方法：取受菌液在营养肉汤琼脂平板上划线。用黑纸覆盖培养皿的一半，然后在15W的紫外线灭菌灯下距离33cm照射8s，37C培养24h。对紫外线敏感的三个菌株（TA、TA”TA】。）仅在没照射过的一半生长，而菌株TA在没有照射过的一半和照射过的一半土均能生长。100l02（4）R因子和pAQl质粒的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄西林的特性，TA】。?菌株含pAQ质粒具有抗四环素的特性。用甲紫抑菌试验的方法：在两个肉汤平板上分别滴加氨苄西林溶液20pl（浓度为lmg/m1溶于0.02mol/LNa0H）和四环素溶液20pl（浓度为0.08mg/ml,溶于0.0

27、2mol/LHCl），在肉汤平板表面涂成一条带，待溶液干后，垂直划线接种4种试验菌株。经37C培养2448h观察生长情况。4个菌株生长应不受氨苄西林抑制，证明它们都带有R因子。TAl02菌株生应不受四环素抑制，证明带有pAQl质粒。2自发回变数测定取已融化并在45C水浴中保温的顶层培养基一管（2m1），加入测试菌液0.050.2ml,迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上平放固化。37C培养48h观察结果。计数回变菌落数。每株的自发回变率应落在表101所列正常范围内。对鉴别性致突变物的反应试验菌株对不同致突变物的反应不同，应该在有和没有代谢活的条件下鉴定各试验菌株对致

28、突变物的反应。可按下述的点试验或平皿掺入试验的方法进行各试验菌株对鉴别性致突变物的反应见表102。4菌株保存鉴定合格的菌种应加入DMS0作为冷冻保护剂，保存在-80C或液氮（-196C）,或者冰冻干燥制成干粉，4C保存。六、实验设计受试物最低剂量为每平皿0.1/pg，最高剂量为5mg，或出现沉淀的剂量，或对细菌产生最小毒性剂量。一般选用45个剂量，进行剂量反应关系研究，每个剂量应做2或3个平行平皿。溶剂可选用水、二甲基亚砜（每皿不超过0.4m1）或其他溶剂。每次实验应有同时进行的阳性对照和阴性（溶剂）对照。七、方法和步骤实验方法有平板掺入法和点试法。一般先用点试法作预试验，以了解受试物对沙门菌

29、的毒性和可能的致突变性，平板掺入法是标准试验方法。平板掺入法在底层培养平皿上写上记号。取已融化并在45C水浴中保温的顶层培养基一管（2m1）,依次加入受试物溶液0.1ml，测试菌液0.050.2ml（需活化时加10%S混合液90.5m1），迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37C培养48h观察结果。点试法在底层培养平皿上写上记号。取已融化并在45C水浴中保温的顶层培养基两管（2ml）,加人测试菌液0.050.2ml（需活化时加10%S9混合液0.5ml）,迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化。取无菌滤纸圆片（直径6

30、mm）,小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如10pl）,点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸上或琼脂表面，37C培养48h观察结果。八、结果与评价点试法凡在点样纸片周围长出一圈密集的his+回变菌落者，该受试物即为致突变物质。如只在平板上出现少数散在的自发回变菌落，则为阴性。如在滤纸片周围见到抑菌圈，说明受试物具有细菌毒性。掺入法计数培养基上的回变菌落数。如在背景生长良好条件下，受试物每皿回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数等于或大于2乘以空白对照数），并有剂量反应关系或至少某一测试点有重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物为诱变阳性。当受试物浓度达到

31、5mg/皿仍为阴性者，可认为是阴性。报告的试验结果应是两次以上独立实验重复的结果如果受试物对4种菌株、（加和不加S）平皿掺人试验均得到阴性结果，可认为此受试物对鼠伤寒沙门菌无致突变性。如受试物对9一种或多种菌株（加或不加S）平皿掺人试验得到阳性结果，即认为此受试物是鼠伤寒沙门菌9的致突变物。九、安全措施与废弃物处理应有专门的实验室，应有良好的通风设备。试验者必须注意个人防护，尽量减少接触污染的机会。受试的致癌物与致突变物的废弃处理，原则上按放射性核素废弃物处理方法进所用沙门菌试验菌株一般毒性较低，具有R因子的危害更小。但要防止沙门菌污染动物饲养室。表101菌株生物学特性鉴定标准基因型自发回变菌

32、株组氨酸缺陷脂多糖屏障缺失抗氨苄西林抗四环素uvrB修复缺陷(-S9)TA97+-+10-180TA98+-+30-50TAl00+-+120-200TAl02+-+240-320表102鉴别性致突变物在点试中试验结果致突变物剂量STATATATA柔毛霉素5.0|Jg+叠氮钠1.0pg-+-+-ICR1911.0pg-+丝裂霉素C2.5|Jg-+抑菌抑菌+2，4，7三硝基芴酮0.1pg-抑菌+4硝基0本撑一胺20.0pg-+4硝基哇琳N氧化物10.0pg-+甲基磺酸甲酯2.0|jl-+-+敌克松50.0pg-+2氨基芴20.0|jg甲基硝基亚硝基胍2.0jg+实验十一致畸试验及胚胎胎仔检查方法

33、一、目的意义具有致畸作用的外来化合物，接触于妊娠母体后，可使处于细胞分化和器官形成的胚胎发育受到影响，导致形态和机能的缺陷，引起胎儿出现畸形。致畸试验室检测外来化合物是否具有致畸作用的一种方法，是毒理学评价程序中不可缺少的重要内容。本实验要求初步掌握致畸试验的方法及如何进行胎仔的检查方法。二、内容1受试动物的处死和检查。2活胎仔外形的检查。3胎仔内脏的检查。（徒手切片法）4胎仔的骨骼检查。三、器材和试剂：、器材1玻璃标本瓶、手术剪刀，无齿镊子、手持放大镜或解剖显微镜、单面刀片和切标本蜡板、感量O.lg药物天平、滤纸、透明米尺、平皿、试剂190%乙醇固定液2鲍音固定液（Bouin）：取苦味酸饱和

34、溶液75毫升，甲醛20毫升和冰醋酸5毫升混合而成。3茜素红染色储备液：取茜素红加入下述混合液中至饱和为止。冰醋酸5毫升纯甘油l0毫升1%水合氯醛60毫升4透明液：透明液I：甘油20份，2%氢氧化钾溶液3份，蒸馏水77份。透明液II：甘油50份，2%氢氧化钾溶液3份，蒸馏水47份。透明液III：甘油75份，蒸馏水25份。纯甘油：长期保存标本用。四、试验设计、动物选择选用的动物对受试物的代谢过程应与人类相似，并具有人类胚胎构造相似的胎盘，其妊娠期较短，有利于观察，且每窝仔数较多，还应符合试验动物的一半要求。如体型小，易繁殖，价廉等。一般常用大鼠、小鼠和家兔。但综合考虑，以大鼠最好，因其自然畸形率较

35、低胎仔大小适中便于检查。、剂量分组致畸试验中，剂量分组的确定较复杂，一般可根据试验目的和通过预试验来确定。一般情况介绍如下：至少应设三个剂量组邙日性和阴性对照）。一般最高剂量不超过LD50的1/51/3，低剂量组为LD50的1/301/100左右；也可以人体试剂接触量为低剂量组，并以其数倍Q0倍以下）为高剂量组；也有人以亚慢性毒性试验中的最大无作用剂量为高剂量组，并以其1/30为低剂量组。、动物处理将性成熟雌雄动物同笼交配，大鼠或小鼠可按雌雄1：1或2：1比例同笼。每天清晨进行雌性动物阴道涂片检查有无精子或阴道栓之日作为受孕第一天（或称作0天），以确定受试动物给予时间及处死日期。确定受孕动物随

36、机分到各剂量组。大小鼠每组不少于1020只。受试物给予方式原则上与实际接触方式一致，以灌胃常用，给药时间应在胎鼠器官形成期，大鼠在第7、8天开始至15天结束。每周称体重2次，以观察受孕情况及调整给药剂量。五、畸形检查、孕鼠处理：1孕鼠处死时间，一般于分娩前12天处死，如小鼠是妊娠第18天，大鼠在妊娠第20天。2处死方法：大小鼠可用颈椎脱臼法。处死前称体重。4剖腹后确认受孕情况。观察胚胎着床数、活胎数、死胎数、吸收胎及黄体数。取出子宫称怀孕子宫重量。、活胎仔的外形检査。1从左侧子宫角剖开，将活仔逐一取出，称量体重，测量身长并鉴定性别。2由头部一躯干一四肢一尾部，逐一检查每只活胎仔有无外形结构的畸

37、形，并将记录结果记入相应的表格中。检查完毕后将胎仔总数的1/31/2放入鲍音氏溶液，供内脏检查。其余1/22/3放入90%乙醇溶液中固定4872小时，供制作标本检查骨骼用。外观检查：头部主要看有无脑膜膨出，露脑等畸形；面部主要观察有无眼耳异位，大小不等，突眼，开眼，唇裂，颜面裂等畸形；躯干主要观察有无腹部脐疝，背部有无脊髓膜膨出，脊柱裂等畸形；四肢检查有无短肢，多趾，少趾，无趾等畸形；尾部主要检查有无卷状尾，短尾，无尾或肛门闭锁等畸形。、胎仔内脏检査：胎仔经Bouin氏液固定约2周后，用自来水冲洗去固定液，胎仔放在蜡板上，剪去四肢和尾巴，采用简单的徒手切片法对胎仔的内脏进行检查，其具体操作方法

38、和检查的内容如下：1头部器官检查：通过下列切面（图4）进行观察检验。用单面刀徒手沿口经耳作一水平切面，使上下颚分开，主要检查有无腭裂、舌缺失或分叉（图5）。将上述切面切下的颅顶部，沿眼球前垂直作额状切面，检查鼻道有无畸形，如鼻道扩大，单鼻道等（图6）。沿眼球正中垂直作第二额状切面，检查眼球有无畸形，如少眼、小眼、无眼或异位等（图7）。沿眼球后缘垂直作第三个额状切面，检查有无脑室扩大，扩大则为脑积水（图8）。检查结果记入相应的表格中。2胸腔、腹腔和骨盆腔器官检查：沿胸腹壁中线和肋下缘水平线作“+”字切开胸腹腔（图9），暴露胸腔、腹腔及骨盆腔内壁器官，然后逐步检查各主要脏器的位置、数目、大小及形状

39、等有无异常。如心脏有无右位、心室中隔缺损、单房室等畸形；肺有无气管食管瘘、肺倒位、少叶或多叶畸形；肝有无异位、少叶或多叶畸形；膈有无缺陷而造成腹内脏疝畸形；肠有无肠疝畸形；肾有无马蹄肾、肾积水、肾缺失、不对称异位及输尿管积水等畸形；生殖器有无子宫缺失、隐睾或缺失一侧或双侧发育不全等畸形；膀胱有无缺失等。将观察结果记入表格中。、胎仔骨骼检查：将经90%乙醇固定48-72小时的胎仔转入1%氢氧化钾溶液中，每隔2-3天换一次氢氧化钾溶液，直至使胎仔的肌肉半透明可见到骨骼为止，此时将1%氢氧化钾溶液丢弃，加入茜素红应用液（以2%氢氧化钾溶液将茜素红储备液配成12%。）进行染色，直至骨骼染成桃红色或紫红

40、色为止，一般需49天，必要时可更换新的染液数次。染色后将胎仔至于透明溶液I、II、III各12天。经透明的胎仔可在肉眼、放大镜或解剖显微镜下观察。颅顶骨主要观察有无缺损。骨化迟缓（表现为卤门过大）；枕骨有无缺失（表现为缺失，分为两点、两线和虚线状）等；颈椎骨有无缺损、椎弓不连续、骨化迟缓等；胸骨有无缺损或消失、融合（椎间盘不清楚、）骨化迟缓（表现为小点状或不及正常的1/2）、分叉肋、波状肋、融合肋、骨化迟缓（为一侧或双侧肋骨呈点状）等；腰椎有无缺失、分裂变形等；四肢骨有无多骨和缺失等；骨盆骨有无缺失；尾椎骨有无缺失、椎弓缺损、融合等。六、结果评定将检查结果以相应的统计学方法进行处理后，根据各组

41、动物出现的畸胎率（胎窝畸胎率、胎仔畸胎率）、胎仔部位、器官畸形率和剂量反应的关系以及多次试验结果一致性等方面来进行综合评定。附录：表111致畸试验处死受试动物检查记录表受试物名称纯度剂量（mg/kg）体重受药途径和方式给予受试物日期和连续天数动物编号受精日期处死日期受精后第七天体重剖腹时体重（g）怀孕情况着床总数活胎数死胎数吸收胎数黄体数胎盘总重（g）备注表112致畸试验的胎仔外观检查记录表受试物名称：剂量（mg/kg体重）动物编号：胎仔编号检查项目表113致畸试验动物胎仔骨骼检查记录表受试动物名称：剂量（mg/kg体重）动物编号：胎仔编号及异常表现主要器官表114致畸试验的胎仔骨骼检查记录表

42、受试物名称：剂量（mg/kgt体重）动物编号：胎仔编号及畸形表现主要骨骼实验十二网织红细胞计数一、原理网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的细胞。胞浆内还残留RNA等嗜碱性物质，黄焦油蓝等能将网织红细胞的胞浆染成蓝色花冠状、网状或点状结构。显微镜下易于识别和计数。二、试剂1煌焦油蓝酒精溶液：准确称取煌焦油蓝1.0g溶解于lOOml无水乙醇中，过滤后备用。三、器材载玻片，推片，滴管，显微镜四、操作方法1在清洁干燥玻片的一端加1煌焦油蓝酒精溶液2滴，等待其挥发后在玻片上形成一层油膜。取血液23滴（末梢或静脉血均可），加到油膜上，立即用推片角将血液与煌焦油蓝充分混匀，然后推成薄片后在显微镜油镜

43、下计数1000个红细胞中的网织红细胞数，将结果换算成网织红细胞百分数。为方便计数，可在目镜内放入网格计数器。正常参考值为相对值：成人：0.51.5；儿童：2.06.0绝对值：1.75万8.25万/pl,平均值6.0万/pl网织红细胞的绝对数计算：网织红细胞数/p1=（网织红细胞数红细胞数/pl）/100五、临床意义网织红细胞增加：表示骨髓红细胞增生旺盛，多见于溶血性贫血、恶性贫血、急性失血等；在对贫血治疗有效时，如用维生素B1。或铁剂治疗缺铁性贫血后网织红细胞数可在一段时间内明显增加。网织红细胞减少：见于骨髓增生低下疾病，如再生障碍性贫血等。六、注意事项取耳垂血、指端血或静脉血均可，但标本必须

44、新鲜（不需抗凝），取血后立即进行活体染色。使用煌焦油蓝酒精溶液做染液，应等待玻片上酒精挥发干后才能加入血液，否则血液易于凝固。附录：动物实验报告的撰写及注意事项实验报告是学生完成实验后，对实验工作经过整理而写出的简单扼要的书面报告。整理实验结果和撰写实验报告是做完实验后最基本的工作,它可以使学生对实验过程中获得的感性知识进行全面总结，并提高到理性认识，知道已取得的结果，以及尚未解决的问题和实验尚需注意的事项。书写实验报告的过程是学生用所学基础理论对实验结果进行分析综合，逻辑思维上升为理论的过程，也是锻炼学生科学思维，独立分析和解决问题，准确地进行科学表达的过程。动物实验报告是描述动物实验过程，记录动物实验结果的材料，是表达研究成果的一种形式。应做到内容准确、明白、文字简练、通顺、书写清楚、整洁。标点符号、外文缩写、单位度量均应准确、规范。一.撰写动物实验报告的原则1.真实性真实性是动物实验报告最突出的特征,动物实验报告对动物实验的全过程都必须如实记录,务必做到实事求是,绝对真实可靠。对动物实验过程的各种现象和结果都要认真、仔细地观察