高效液相色谱方法的建立

1、高效液相色谱方法的建立高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法。它广泛用于合成化学、石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。它应用如此广泛，那么问题来了，我们在选择液相色谱法时该如何建立方法?如何建立一个HPLC的方法?能够开发一个新方法对于HPLC的初学者来说有很大吸引力，旦是新手往往会感觉无法下手，其实完全不是那么一回事，只要你有一台双泵或者四元泵的HPLC,看了本文，就可以上手去做了。首先我们要保证的一个根本原则是：我们要做出来的是一个有稳定，明显的分离，并且在检测器的响应明显，有定量理论基础的方法。这句话中的“稳定”、“明显”是必要条件，有一点不达标方

2、法就没意义。然后，对于新手来说，最好遵守这样一个小原则：我们从不新建，我们只是套用高效液相色谱方法的建立样詁制备分關模式的遥择色谱柱的选释*流动相的选择洗脱方式的优化检测方式的选择HPLC方法曹立的步骤收集样品信息*明确分析的目的和要求选择样品制备方憩确定检测方法和条件确定HPLC分祈檢式，选择相应色谱粒*优化分离離件-定性.定址分析方法验证样品信息样品中的化学成分，及各或分的含盘范围化合物的结构或官能团化舎物的分子量化台物的酸就性和pK养pith值适宜的样品溶剂及溶解度化合物的紫外服收光谱分析目的和要求*准确度，分离度灵敏度主虑分的定性、定量分析速度-杂质分析”如有关物质及陈解产物尊药物代谢

3、勒力学或药物代谢物研究中药有效成分或捋标成分的定性.定盘中药措纹图锻分析*合成聚含胸或生物大分子的分子量我获井布或序列分析吗实崟日的.吗实崟日的.tl樣分折舸.膛輛耍驻尊选择适岂的样品处現方法霜解、稀執过滤趣声萃戰带剖萃収*闹棚萃取*多种方式联台使用-柱前衍生，柚后衍生注帝匚供试品洛割与色谱条件的匹配HPLC模式的选择HPLC模式的选择HPhC分离模式及应用范围HPhC分离模式及应用范围哲講柱盘用范出矗傅MNJLCIS.cs.tft.M備请F朮育凯观音幣敢的申畝冲蚌痕iPaWM-Fl圮售坊盘耳干烷呑整flQinLC莆帕VUgtiHi捕IO1Ur=瓊林本欄于卓书侶育増我的比吿柏N(W立井，也*$

4、KURO田豪爭丈悽IE阳讣交農齐燈，耐】畫泅于井蔦血盲直离屮色購rftTTWn&e札相iH：Ja则常fl(ttPOUK-!l|ttiGPi-zKKMjcfkfrfc.片竄察世4MEK.柞玛沖.frTWJW真4fl互tIUflfr兴中瓦柿划科忖蔬水吃小押字贰弭机带IT光耶肾性产1鷲静供*选择色谱柱L根据样品特址选择分离模式根据色谱柱性能根据分离规模来选择柱砸件状态色谱柱的选择反相硅肢龜合色谱柱牲能卷敌讦毎輕抵童昨廣祕M性序孔枪，曆軋番不问m僧血力.井育甘弃4*4哝轻主中巧，同为瘙崑培均也倉.洙M相Jt桂4R19!7-rt2nrnBMrs-m崔用創孔春着舟子翼図It-frKit甘*13子.鶴斗*f

5、f廿才古建耳trttsmn口!V牧减陆丰少ttviRumH*Ktrim耳MKRtVX.flWzfttt.TTFB-ftJB甬：九厦站用嵐!1PK1-c流动相的选择反相色谱有机洛制：甲SL绅.四组映睛畀丙醇導戡：瞬嚴,乙熟甲酸.三艺酸尊僚:三邑臨稀瓠水违載色请柱的号受性零克呻对试?Rh嫌基硕栽钠丸讯化四丁基整聲缓冲盐；碑脱盐，醋酸盐榆母帔盐零检测方法的选择折光檢寞審科憑笈光敵射检諾罄t週用：糕环娥乏UWfi应】嶂面豹白一牝测宦秦知成分的含豎t灵数度相对较養蔬光检测憎：选择性.较禹興敏度B!/nMH；对温度.爲剂性圖pHft-电化学梯溝Sh选萍性校禺灵龜度;；对流連温度需于强乱PH欝堆骼；锥护絞麻

6、烦、质诺检為器】选捽性灵敦度谨用性*化。佝分于量矗站枸何恵：柑对较贵ift渤相独越赭裁隹处的吸枚血应紫外检测ift渤相独越赭裁隹处的吸枚血应霰至菠长一、在食品分析中的应用1.食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等;2.食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等;食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。二、在环境分析中的应用环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等三、在生命科学中的

7、应用HPLC技术目前已成为生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具。其在生化领域的应用主要集中于两个方面：1.低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。2.高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感性趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测;制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。体液中代谢物测定;药代动力学研究;临床药物监测：