小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定

1、小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定田蓉，李巍，于继云，刘玉峰【关键词】树突细胞Invitrultureandharaterizatinfusespleendendritiells【Abstrat】AI:Texplreandptiizetheethdsfrinvitrulturefusedendritiells(D)thaterethenbservedrphlgiallyandidentifiedbilgially.ETHDS:ieereinjetedith200g/kgylphsphaidethrughthetailvEin,anderesarified8dlater.Spleenellsereu

2、lturedithrdinaryethdsfirstly,and3dlaternditinalediuntainingIL4,GSFasadded,andTNFasaddedatday5.Atday8,ellseresubjetedtphasentrastirspe,sanningeletrnirspe,andtransissineletrnirspeanalysis.Atday3,5,7,ellseresubjetedtFASfrdetetinfellsurfaearkers.RESULTS:ulturedellsdisplayedatypialDphentypeinrphlgialanal

3、ysis,andFASshedtheseellsexpressingsuhDarkersasD11,D86,Ab,H2D6.NLUSIN:UsingfIL4,GSF,TNFasstiulatrsintheusespleenellultureanbtainDithhighqualityandhighpurity,hihakesafundatinfrfutureresearhnthebasiandlinialusagefD.【Keyrds】dendritiells;ytkines;Hleule【摘要】目的：探究、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞D的方法，并进展形态学观察和生物学鉴定.方法：应用环磷

4、酰胺200g/kg经尾静脉注射Balb/小鼠，8d后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日参加含有IL4,GSF细胞因子的条件培养液，第5日补加TNF,第8日制备标本进展相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，并分别在培养第3,5,7日经流式细胞仪检测成熟细胞外表标志.结果：刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，具有典型的D形态，流式细胞仪检测发现细胞外表表达D11,D86,Ab,H2D6标志物.结论：在小鼠脾脏细胞培养中参加IL4,GSF,TNF等刺激，可获得足量、较高纯度的D，为D的根底研究与临床应用奠定了根底.【关键词】树突细胞；细胞因子；H类分子0引言自从Steinan等于1973年

5、发现树突状细胞dentritiell,D以来1，D作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的才能，日益引起国内外学者的关注.特别是D与肿瘤免疫的亲密关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域.D来源于骨髓D34+细胞2，获得一定量有功能的D是深化研究其生物学功能的关键，然而D在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚缺乏白细胞总量的1%.目前体外培养D的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对D根底和临床工作的开展.我们在体外培养扩增了Balb/小鼠的D细胞，在培养中添加IL4,GSF,TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分

6、析对所培养细胞进展鉴定，为优化D的体外培养方法进展积极的探究.1材料和方法1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体：D11FIT,IAbFIT,H2DbFIT,D86FIT购自Dialne公司；rGSF,rIL4,TNF，胎牛血清，DE培养基，胰蛋白酶购自美国GIBL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Siga公司；倒置相差显微镜为日本lypus公司消费，低速离心机为北京医用离心机厂消费，微量台式高速离心机为德国Heraeus公司消费，流式细胞仪为ulter公司消费，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司消费；68k龄雄性Balb/小鼠购自军事医学科学院实验动物中心.1.2方法1.2.1

7、D细胞的别离与培养将环磷酰胺按200g/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8d后颈椎脱位处死小鼠，750L/L乙醇浸泡10in，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后搜集滤过的细胞悬液，离心800r/in,7in，加TrisNH4l3L，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1109/L细胞，37，50L/L2孵箱培养.3d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rGSF/rIL4条件培养基隔日半量换液，第5d补加细胞因子TNF1g/L，第7d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日搜集悬浮的细胞即为富集的D.相差显微镜下观察细胞形态特点.1.2.2扫描

8、电镜观察取如上培养7d的细胞悬液，接种放置在培养皿中的盖玻片上，37，50L/L2孵箱培养.待细胞集合，取出盖片，浸入PBS漂洗细胞外表；将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4预冷的40L/L戊二醛，在4固定2h，吸出固定剂，PBS浸洗2次，每次10in，再用4预冷的10g/L锇酸固定，在4固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10in；用系列梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，2临界点枯燥，扫描电镜观察细胞外表构造.1.2.3透射电镜观察取如上培养7d的细胞悬液，PBS洗涤，细胞沉淀用40L/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察细胞超微构造.1.2.4细胞外表标记FAS分析分

9、别搜集培养第3,5,7d的细胞，离心800r/in,7in，弃上清，用含20L/L牛血清的PBS洗液1L洗涤2次，分别加终浓度为5g/L的标记抗体1LD11FIT,IAbFIT,H2DbFIT,D86FIT.设阴性对照组.4轻度震荡30in；再用PBS1L洗液洗涤2次；间标抗体再参加FIT标记羊抗鼠lgG,100L/管，终浓度为5g/L，4避光轻度震荡30in，PBS1L洗液洗涤2次，加10g/L多聚甲醛400L固定，上流式细胞仪检测.2结果2.1D的别离与培养经尾静脉注射环磷酰胺的小鼠，饲养8d后，脾脏明显增大，为正常小鼠脾脏体积的3倍左右，脾细胞数平均7.5107/只.镜下观察细胞体积较大

10、、均匀、圆形，参加GSF20g/L,IL41g/L体外培养3d后，增殖出大量悬浮的粒细胞及疏松黏附于贴壁单核细胞上的增殖性细胞集落.第8日搜集已脱落的及疏松黏附的细胞集落，即为富集D.2.2相差显微镜观察培养7d的D，相差显微镜下可见较大体积的悬浮细胞，具多形性，贴壁时有细长突起，“呈树突状，悬浮时向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，呈“刺猬状，局部伸展为不规那么状图1.图1培养D的相差显微镜观察100略2.3扫描电镜观察培养7d的D，扫描电镜下可见细胞伸展出大量大小不一、扁平的胞质突起，末端圆钝，细胞膜光滑无皱折图2A.2.4透射电镜观察培养7d的D，透射电镜D胞体周围可见不规那么突起和褶皱；胞

11、核染色深，偏向一侧，形状不规那么，多为分叶状；胞质线粒体较为丰富，较多吞饮大泡及小泡，高尔基体、溶酶体少.所培养细胞具有典型的D形态特征图2B.A：扫描电镜；B：透射电镜.图2培养D的电镜观察1000略2.5细胞外表标志FAS鉴定应用流式细胞仪分析体外培养第3,5,7日，及补加细胞因子TNF后第7d的D外表标志显示：N418D11细胞比例分别为16.22%,13.54%,34.37%,78.16%;HIIIab细胞比例分别为28.80%,21.88%,25.85%,58.45%;HI类H2Db细胞比例分别为4.82%,2.46%,11.94%,24.635;B72D86细胞比例分别为77.89

12、%,59%,75.71%,80.59%;随着细胞成熟，HI类分子、HII类分子、共刺激分子的表达逐渐增高，参加TNF后，所测D各外表标记均有较明显的增高，显示出TNF在D的成熟分化中的突出作用.流式细胞仪分析细胞表型结果证实所培养的细胞为淋巴系D.3讨论D在组织中分布广，但含量极少，因此建立成熟的D体外培养技术获得足够数量的有功能的D就显得非常重要3.1992年，StEinan实验室首先建立了用GSF从小鼠骨髓中大规模培养制备D的方法，目前，小鼠D的来源仍主要采用这种方法.但新近研究说明4，假如应用亚致死量化疗或放疗药物处理小鼠，使D前体细胞重新定位于脾脏，在特定的造血环境下扩增，再取出以GS

13、F或GSF+IL4培养，就能扩增出大量D，且具有产量大、纯度高、稳定性高、操作简便等特点.在上述工作根底上，本实验予高剂量200g/kg体质量环磷酰胺经尾静脉注射小鼠，8d后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经GSF20g/L+IL4g/L培养，第5日补加细胞因子TNF，第8日，获得了大量淋巴系D，每只小鼠平均可得7.5107细胞数，较文献报道细胞数高.将培养细胞悬液在相差显微镜及电镜下观察，发现所培养细胞具有典型的D形态特征，均明显有别于单核细胞和巨噬细胞5.D的发育、成熟与其在体内的迁徙过程和细胞外表标记的变化之间的复杂关系，是其重要的生物学特点6.D并不是一个均一的群体，但所有的D均来源于骨

14、髓干细胞，不管是组织D还是培养D，不管是人D还是小鼠D，均可区分为非成熟和成熟两个阶段7.非成熟D主要位于易与外来抗原接触的外周器官，细胞外表较高表达与吸收和加工抗原有关的分子，如D1A，R6；而当D细胞完成抗原加工功能，向次级淋巴器官迁徙的过程中，那些影响D细胞迁徙、提呈抗原、激活T细胞的趋化因子、黏附分子、HI类分子、HII类分子及共刺激分子，包括D1,D4,D33,D40,Iab,H2Db,D80B71，D86B72等的表达逐渐增加，最终，D转变成为可以专职递呈抗原、发挥免疫功能的成熟D8-9.我们分别搜集所培养第3,5,7日及补加细胞因子TNF后第7日的D，应用流式细胞仪分析细胞的表型

15、，结果显示所培养的D已表达了主要外表标记，并随时间变化总体呈现上升趋势，在培养第5日有所降低，但到第7日时，均明显升高，由于所测外表分子均为成熟D主要的标记，所以表型的变化规律根本符合D的成熟过程.培养D外表这些分子的升高或较高比例的表达，说明其已成为有可能发挥功能的抗原递呈细胞.另外，我们注意到，在培养第5日补加细胞因子TNF后，D外表的标记分子明显上升，这进一步证实了TNF在D发育、成熟中的作用.可能的机制为：TNF作为第一信号，可上调并维持干细胞的GSFR，抑制干细胞朝粒系转化；上调的GSFR在承受GSF的刺激后，进一步朝D方向开展.实验结果中有些标记分子的表达比预期的以及理论上的表达量

16、低，可能是由于体外培养D的各种环境和条件与体内还存在着不同以及操作上的某些差异造成的，但结合细胞形态及外表标志物整体分析，本实验已培养出了具备典型成熟D特征的细胞，为进一步讨论D体外对T淋巴细胞的激活作用及抗瘤作用奠定了根底.【参考文献】1SteinanR,hnZA.IdentifiatinfanvelelltypeinperpherallyphidrgansfieI.rphlgy,quantitatin,tissuedistributinJ.JExped,1973,137(5):1142-1162.2KleindienstP,BrkerT.Endgenusdendritiellsarereq

17、uiredfraplifiatinfTellrespnsesinduedbydendritiellvainesinvivJ.JIunl,2022,170(6):2817-2823.3respI,PaivaA.IunphentypiandfuntinalharaterizatinfrdblddendritiellsJ.SteellsDev,2022,13(1):63-70.4PspisilvaD,BrvikvaJ.ethdsfdendritiellpreparatinfrautelyphblastileukeiaiuntherapyinhildrenJ.ednl,2022,22(1):79-88

18、.5SandellH.DadabayeyAR.Prgnstivaluefturinfiltratingdendritiellsinlretalaner:RlefaturatinstatusandintraturallalizatinJ.linanerRes,2022,11(7):2576-2582.6AnderssnBU,TaniE.Prgnstivaluefturinfiltratingdendritiellsinlretalaner:RlefaturatinstatusandintraturallalizatinJ.linanerRes,2022,11(7):2576-2582.7HaadaI,Kat.linialeffe