环境微生物的宏基因组学研究进展

1、环境微生物的宏基因组学研究进展摘要:在当前的实验室条件下自然界中约有99%的微生物不可培养,这使微生物资源的开发利用受到了限制。宏基因组技术通过不培养微生物而直接对环境中总DNA进展克隆挑选来打破这个瓶颈。宏基因组技术如今已经用于各种微生态环境的研究中,大大加深了我们对环境中的微生物多样性以及微生物功能的认识。关键词:宏基因组;不可培养微生物;挑选系统中图分类号:Q75文献标识码:A文章编号:1674-0432(2022)-06-0044-30引言ese和Pae基于16SrRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化。在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界

2、和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差异。伴随着克隆和测序技术的开展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性。近年来一些学者对微生态学和宏基因组进展了研究。以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术。1宏基因组的研究1.1DNA的别离环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量。Tiedjie等开展了从不同类型的土壤中直接别离DNA的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中可以获取全部的总DNA。尽管utis等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤别离细胞再从中提取DNA所得到的细

3、菌多样性范围并无重大差异,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性。不同的方法适用不同的环境。比方,Frtin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量。选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息。在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的。Nker和aper说明,用ethidiunazide(EA)的衍生物分析成熟的生物膜16SrRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别。对环境中

4、的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外。水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,rinaldesi等人改良了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用。1.2系统发生和宏基因组的分析DNA提取方法的改良、测序手段的进步和测序本钱的降低使我们可以解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性。Ainas等运用不同的PR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16SrRNA文库。这两个文库的比拟说明了PR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列。尽管如此,PR的误差仍然不能说明样品中的所有16SrRNA基

5、因的微小差异(1%的序列差异)。97种已完全测序细菌全基因组比拟说明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16SrRNA基因。序列分析还说明任何基因组中的16SrRNA内部操纵子的差异在1%以内。引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Ainas等预测这些样品中至少包含了446种严密相关的基因组。因此这些数据间接的说明了这个种群内部包含有大量相似的种类。基因序列也开场用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战。在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信

6、息。比方在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进展分析。在Tysn等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内。而许多自然环境中种群构造高度复杂,不能采用如今的方法。据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌。要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列。为了防止对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因。基因定量包括对特定生态环境能反映环境特点的环境样品的分析。以基因比拟为中心对特定环境中基因定位给

7、我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题。处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16SrRNA基因克隆到单一的载体里面。其中,SARST(serialanalysisfribsalsequenetags)发现了V1或V6高变区。这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去。用这种方法,单个测序反映能到达的序列标记可达20个。这种方法可以鉴定菌群可到达属的程度。vanderLelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系

8、很近的菌株。一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rp,uvrB,reA和16SrRNA基因。在这些基因中,16SrRNA是差异最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以到达属的程度,很大一局部还可以分辩到种的程度。近年来,以16SrRNA基因为根底的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法。这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成。不同原型的阵列已经开展并开场用于估计环境种群中微生物的多样性。这种以16SrRNA基因为根底的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具。复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能开展为基因芯片。一个

9、完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对将来的展望。Hng等人描绘了一种基因芯片的概念,这种芯片通过别离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者RNA来实现。基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群构造的认有着非常重要的意义。直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进展。在对细胞、量很少的环境进展宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法。Abulenia等描绘了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法。从严重污染和细胞密度极低的地表下土壤样品中提取DNA,29DNA聚合酶用于扩增总基因组。通过第一次基因组DNA的扩增,污染的土壤中细菌多样性分析

10、,和细菌基因组文库构建是可能的。尽管存在扩增的偏好现象,在一个微小的细菌样品中扩增宏基因组DNA,仍然可以得到一些以前无法得到的基因组的信息。1.3挑选宏基因组表达文库另外一种方法是通过构建和挑选宏基因组表达文库,或者通过测序和限制性内切酶的方法来筛眩直接挑选宏基因组文库的一种局限就是需要超高通量的挑选系统,或者大量的可用的挑选的阵列。可以通过富集基因的方法来挑选由数百万个基因组成的宏基因组文库中的稀有基因。其中一种富集的方法是底物诱导表达挑选(substrate-induedgeneexpressinsreen,SIGEX)。Uhiyaa等完善了一种高通量的SIGEX挑选方法,他们将目的基因

11、和绿色荧光蛋白(GFP)连接起来,转到表达载体内,通过检测激发的荧光来检测相应的克拢宏基因组DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通过FAS方法来排除所构建文库中组成型表达gfp的克拢再将未表达gfp的克隆转移到含有靶标底物的培养基中,通过诱导gfp基因表达来挑选克隆子。这种挑选体系的机理是:分解代谢相关的基因可以在特定代谢物的作用下被诱导表达。1.4通过培养方法获取不可被培养的大多数微生物要大量准确测序复杂环境中的微生物DNA样品,不是一件很容易的事情,这也说明了全面的获取微生物信息的方法的重要性,可以通过这些信息来理解微生物间及微生物与环境间的互相作用。尽管环境基因组可以提供大量的信息,但

12、对生理学,生态学和进化学有重要影响的分类单元中可培养微生物单菌落的会给生态小环境的研究带来深远影响。Prterhdpsin的发现及它的编码基因存在于Pelagibaterubique证明了获取可培养单菌落的作用。Prterhdpsin编码基因是在海水和环境微生物宏基因组的克隆测序过程工程中第一次被发现的,但是我们不能确定不可培养的微生物基因组中包含Prterhdpsin基因。通过培养Pelagibaterubique,我们就有可能将Prterhdpsin与固定的种类联络起来。许多研究者们正在努力研究与模拟专一的可培养的微生物,并且利用将这些微生物来研究它们环境中所处的地位和发挥的作用。基因组测

13、序已经为我们提供了大量的信息并理解这些微生物在环境中的作用。经典的微生物培养策略都是一贯地给微生物系统提供过量的营养,从而导致能形成菌落或薄膜的和快速生长的细菌富集。对于依赖稀释培养基或模拟自然环境培养基才能生长的细菌,Ferrari等人描绘了一种模拟自然环境条件的用于培养土壤微生物的新颖方法。他们研究组所采用的泥浆膜系统中,一种聚碳酸酯是作为生长培养支持物,土壤提取物作为培养基。研究结果是长出了大量的未被鉴定的微型菌落。Kepke等人将多种不同的培养方法应用到沿海地表下的沉积物,研究发现多数情况下没有一组微生物可以在几种培养方法中都被培养出来。他们的研究肯定了这个观点:没有一种单一的培养方法

14、或者培养基适用于别离专一样本中的多种多样的微生物。同时采用低营养条件富集和分子方法,在冰岛富含中性硫化物的热温泉中得到了具有一种高度差异型的淀粉酶基因。使用热温泉水的微生物富集方法采用低浓度淀粉和长时间温育,最后选育出可以降解淀粉但生长缓慢的微生物。在培养之前,将样品中的多种特定的微生物选择性地别离出来可以降卑微生物群落的复杂性。iteva和Brenhley的过滤培养,结合长时间温育,使一些新颖而极小的细胞菌落得到富集。这种方法对于研究极端条件下的微生物的代谢特性及长时间存活机制是很有益的。2结语要得到不可培养的大多数微生物的信息,还有很漫长的路要走。在不久的将来,使用更廉价更快捷的测序方法,

15、环境工程测序技术将会产生更加多样的数据和信息。然而,测序并非我们认识环境微生物的唯一方法。我们需要一种新技术,它可以针对直接分析和估量环境和培养条件下的微生物细胞,并且尽可能地和自然界真实的状况接近。对于单个微生物细胞进展完全的特征分析也是一项很有意义的工作。虽然在当今的条件下还没能实现,但是关于单细胞微生物学已是一个很明显的趋势,能让我们解决更多悬而未决未的环境微生物的问题。总之,在工程学,生物地球化学,生物化学,生物信息学,生理学和生态学等多种学科快速开展的根底上,宏基因组学的研究将会使我们进一步加强对于环境对微生物多样性分析的理解和对微生物环境功能的认识。参考文献1Keller,Zeng

16、lerK:Tappingintirbialdiversity.NatReviirbil2022,2:141-150.2DeLngEF:irbialunitygenisintheean.NatRevirbil2022,3:459-469.3DanielR:Theetagenisfsil.NatRevirbil2022,3:470-478.4LunaG,DellAnnA,DanvarR:DNAextratinpredure:aritialissuefrbaterialdiversityassessentinarinesedients.Envirnirbil2022,8:308-320.5NkerA

17、,aperAK:SeletiverevalfDNAfrdeadellsfixedbaterialunitiesbyusefethidiunazide.ApplEnvirnirbil2022,72:1997-2022.6rinaldesi,DanvarR,DellAnnA:SiultaneusreveryfextraellularandintraellularDNAsuitablefrleularstudiesfrarinesedients.ApplEnvirnirbil2022,71:46-50.7Vgel,T.etal.TerraGene:ansrtiufrthesequeningfasil

18、etagene.NatureRev.irbil.2022,7:252.8Baveye,P.Tsequenernttsequenethehle-siletagene?NatureRev.irbil.2022,7:756.9VanderLelieD,Lesaulnier,rkleS,GeetsJ,TaghaviS,DunnJ:Usefsingle-pintgenesignaturetagsasauniversaltaggingethdfrirbialgenesurveys.ApplEnvirnirbil2022,72:2092-2101.10LyA,Shulz,LuekerS,Shepfer-endelsA,StekerK,Baranyi,LehnerA,agner:16SrRNAgene-basedlignuletideirarrayfrenvirnentalnitringfthe