转录因子PAX5在儿童急性白血病细胞中的表达

1、转录因子PAX5在儿童急性白血病细胞中的表达张蓓，帖利军，叶启东，顾龙君，汤静燕，袁向亮，沈立松【摘要】为了不雅察相识儿童急性白血病细胞中转录因子PAX5的表达特性，接纳及时定量RT-PR要领测定了6个血液肿瘤细胞株以及6例正常儿童、58例初发和4例复发急性白血病儿童此中包罗39例B-ALL，10例T-ALL和13例AL骨髓细胞中PAX5和D19RNA的表达程度。效果表白：在NaalaB细胞系细胞株中，PAX5和D19RNA相对表达量别离为2.35%和2.52%；而在T-和髓系细胞株中险些不表达。在临床样本中B-ALL组比T-ALL组和AL组的PAX5RNA表达高P=0.029和P=0.013

2、。T-ALL组和AL组的PAX5RNA表达水均匀低于正常比拟组，而T-ALL组与AL组之间的表达差异无明显意义。在B-ALL患儿中，PAX5RNA表达的个别差异很大。别的还创造，初发治疗前组和复发组的B-ALL患儿PAX5RNA表达高于化疗完全缓解组P=0.011和P=0.006。由于在D19基因的启动子上有B细胞特异性激活卵白的结合位点，研究创造在B-ALL中PAX5表达程度与同样用及时定量RT-PR检测的D19表达程度之间存在显着的相干性。结论：运用及时定量RT-PR要领能快速正确地在B-ALL的临床标本中检测和定量PAX5基因的表达。研究中创造部门B-ALL中PAX5RNA表达显着升高，

3、因此它可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点。【关键词】转录因子ExpressinftheTransriptinFatrPAX5inhildhdAuteLeukeiellsKeyrdstransriptinfatr；PAX5；D19；auteleukeiell；real-tieRT-PRPAX5基因是成对区PAX基因家属的成员，它编码的核反式作用因子B细胞特异性激活卵白B-ellspeifiativatrprtein，BSAP在发育的中枢神经体系、成人睾丸和B淋巴细胞中表达1。在B细胞发育历程中，PAX5基因的转录起始于Pr-BPre-B1期，表达于Pre-B和成熟B细胞中，但在

4、浆细胞中不表达1，2。BSAP通过与多种B细胞特异性基因如D19，VpreB，RAG2，b-1启动子或加强子上的BSAP结合位点结合，对这些基因的表达起着调控作用，因此BSAP在B细胞定向分化、发育、增殖、同型转换、免疫球卵白排泄和终末分化阶段中发挥了紧张的作用1。比年来研究表白，PAX5基因在成神经管细胞瘤、成人恶性胶质瘤、淋巴瘤和人膀胱移行细胞癌中表达失调，而且与恶性分化程度相干3。在血液肿瘤中，以往有关PAX5的研究重要范围于在淋巴瘤中的改变4-6。有关PAX5在急性白血病尤其是急性B淋巴细胞性白血病中较为细致的研究迄今为止文献报道很少5，6。本研究在RNA程度运用及时定量RT-PR检测

5、血液肿瘤细胞株、儿童急性白血病细胞及正常儿童骨髓细胞中PAX5RNA的表达程度，从中相识PAX5在儿童急性白血病中的表达特性，为进一步明白其在急性白血病产生中的作用机制奠基底子，同时也为使用PAX5基因表达产物作为埋伏肿瘤标识表记标帜和基因治疗靶位的应用方面提供根据。质料和要领血液肿瘤细胞株及造就6个血液肿瘤细胞株：Naala、SUP-2、K-562、NB4、HL-60、Jurkat用含2l/L谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPI1640造就液在37、5%2及饱和湿度的造就箱中造就。临床病例泉源2022年2月至2022年2月新华病院、上海儿童医学中央收治的初发和复发儿童急性白血病患者62例，此中初

6、发病例58例，复发病例4例；男45例，女17例；年事4个月-15岁，中位年事6岁。全部患儿均接纳I即细胞形态学、免疫表型、细胞遗传学及相干的分子生物学分型诊断。按FAB分型，ALL49例包罗L115例，L221例，L37例，未分亚型者6例；AL13例包罗11例，2a3例，2b1例，32例，42例，53例，71例。在ALL中，按免疫表型可分为T系-ALL10例和B系-ALL39例；39例B系-ALLD19+还可进一步分成4个亚型，别离是：PrBD10-/ytplasi-1例，ALL即n-B-ALL，D10+/-26例，PreBD10+r-/+11例和Bell即ature-B-ell，SIg+1例

7、。另网络13例B系-ALL患儿诱导缓解治疗竣事时微小残留病RD监测0.01%的骨髓标本作治疗后比拟，此中男10例，女3例；年事3-7岁，中位年事5岁，免疫亚型为：1例PrB，7例ALL，4例PreB，1例Bell。别的，接纳6例非血液体系疾病重要是先本性心脏病手术患儿的骨髓B和8例门诊做康健体检儿童的外周血PB作正常比拟，此中男9例，女5例；年事1-16岁，中位年事5.5岁。网罗上述正常比拟儿童及白血病患儿的骨髓或外周血标本2-3l肝素抗凝，用淋巴细胞分散液室温300g离心30分钟，分散单个核细胞，再用PBS洗涤2次，取约5106个细胞加TRIZL试剂1l，混匀后，-80保存，待提取RNA之用

8、。初发和复发病例标本中白血病细胞的百分比80%，需要时B系-ALL标本可通过D19单克隆抗体免疫磁珠分选法富集白血病细胞拜见Iunteh公司免疫磁珠分选说明书。RNA提取和DNA合成及时PR及时定量PR运用TaqanUniversalPRasterix试剂盒在ABIPris7000及时荧光定量PR仪上检测。PAX5、D19和GAPDH的引物和探针接纳TaqanAssays-n-Deand基因表达产物，其GB探针以FA染料作为荧光标识表记标帜。及时PR反响体积25l各含TaqanUniversalPRasterix212.5l，20Assay-n-DeandGeneExpressinAssayi

9、x1.25l以及25ngDNA模板。PR反响条件为：预热502分钟激活urail-N-glysylase，9510分钟灭活UNG酶，同时激活ApliTaqGldDNAPlyerase，紧接着40个循环的9515秒变性和601分钟退火和延伸。本研究同时把Naala细胞株RNA反转录成的DNA举行系列稀释作为及时PR扩增模板举行PR扩增，以证实靶基因PAX5、D19和内源操纵物GAPDH的扩增服从根本雷同。由于全部的PR反响具有根本同等的扩增服从，因此就可以用比力t法的相对定量计谋，即每个样本PAX5、D19的相对RNA表达程度能直接用样本各自的内源操纵物GAPDH表达来尺度化参加的初始RNA量。

10、简朴地说，每个样本中靶基因PAX5、D19的相对RNA表达程度可以用以下公式盘算：相对RNA表达=2-t100%，式中t值=靶基因t值-GAPDHt值。统计学处置惩罚用SAS6.12统计软件包和SigaPlt2001，Versin7.101软件处置惩罚数据并绘制统计图，PAX5RNA相对表达量用xSD%表现，接纳t查验和线性相干与回归举行阐发。P0.05被以为有统计学意义双侧查验。效果血液肿瘤细胞株的PAX5和D19RNA表达本研究运用及时RT-PR比力t相对定量法，检测了6个血液肿瘤细胞株中PAX5和D19的RNA表达，创造人成熟B细胞性淋巴瘤细胞株Naala的PAX5和D19RNA相对表达

11、量别离为2.35%和2.52%；而T细胞株SUP-2和Jurkat的PAX5RNA表达极微量，别离为0.0033%和0.0018%，且未检测到其相应的D19RNA表达；髓系细胞株K-562、NB4和HL-60PAX5RNA表达均为阴性。急性白血病儿童与正常比拟儿童的PAX5RNA表达本研究运用及时RT-PR检测了临床初诊和复发的39例B-ALL、10例T-ALL和13例AL骨髓白血病细胞PAX5RNA的相对表达量，同时也检测了6例非血液体系疾病儿童骨髓和8例康健儿童外周血单个核细胞PAX5RNA的相对表达量作正常比拟。图1表现了上述差异范例的急性白血病和正常比拟中PAX5RNA相对表达量的漫衍

12、，从中可见B-ALL的PAX5RNA相对表达量范畴变革很大，从0.12-61.13%不等。表1列出了急性白血病儿童与正常比拟儿童均匀PAX5RNA表达量的比力。统计表白：B-ALL组的均匀PAX5RNA表达量比T-ALL组和AL组高P0.05，而与正常比拟B和PB组的均匀表达量差异无明显意义P0.05。T-ALL组与AL组之间的均匀PAX5RNA表达量差异也无明显意义P0.05，但其别离与正常比拟B和PB组的均匀表达量差异有非常明显意义P0.01。别的还创造正常比拟B组与PB组的均匀PAX5RNA表达量差异在统计学有明显意义P=0.043。Table1.parisnfPAX5RNAexpres

13、sinbeteenauteleukeiaandnralntrl略B-ALL儿童的PAX5RNA表达初发和复发B-ALL患儿骨髓白血病细胞的PAX5RNA表达范畴变革很大，从0.12%到61.13%，均匀表达9.6513.21%，不存在性别差异男女患儿均匀表达别离为8.5312.13%、13.4116.58%，P=0.337。本研究仅检测了1例1岁男性患儿，PAX5RNA表达为5.37%；1-10岁组30例，均匀PAX5RNA表达为10.9814.53%；8例10岁患儿的均匀PAX5RNA表达为5.226.34%，两组之间差异无明显意义P=0.284。根据FAB分型，L1、L2和L33组之间的P

14、AX5RNA表达经两两比力差异均无明显性意义P0.05。比力差异化疗阶段B-ALL患儿PAX5RNA表达创造：初诊化疗前组患儿与复发组患儿的均匀PAX5RNA表达差异无明显意义P0.05，而化疗缓解RD0.01%组患儿的均匀PAX5RNA表达落落，与初诊化疗前组和复发组患儿的差异均具有明显意义P0.05表2。Table2.parisnfPAX5RNAexpressinsinB-ALLatdifferentstagesfthedisease略本研究在运用及时RT-PR检测临床病例和正常比拟的样本中PAX5RNA相对表达量的同时，还检测了样本中D19RNA相对表达量。通过统计阐发39例B-ALL样

15、本中PAX5RNA与D19RNA相对表达量之间的干系创造：在RNA程度上PAX5的表达与D19的表达之间存在显着的相干干系r=0.516，P=0.0008图2。讨论儿童急性白血病以急性B淋巴细胞性白血病为主是严峻危害儿童生命的恶性肿瘤。随着医学科学的进步，当前以化疗为重要本领的综合治疗已使大多数急性白血病患儿经治疗后可得到缓解，但终极仍有部门患儿复发。对付白血病简直切发病机制如今尚不明晰，因此从细胞发育、增殖、分化等方面多角度深化研究儿童急性白血病产生生长中的表达特性，从中渐渐明白其产生气理，将为白血病的治疗提供新的思绪并将进步白血病的治愈率及恒久无病保存率。在淋巴造血体系中，PAX5/BSA

16、P被以为是B细胞特异性的标识表记标帜。如今临床上对付PAX5/BSAP的研究重要会合于运用免疫构造化学检测正常淋巴构造细胞和血液肿瘤重要是淋巴瘤构造细胞中BSAP的表达4-6。Krenas等4和Trlakvi等5对较大数目的多种亚型淋巴构造标本中BSAP表达的研究表现，BSAP仅表达于正常和肿瘤的B细胞中，且在差异的B细胞亚类和B细胞非何杰金氏淋巴瘤亚型中PAX5表达的程度各不雷同，而在T细胞和T细胞性淋巴瘤细胞中表达为阴性。然而新近同样的研究，Zhang等6的陈诉却表现PAX5在1个T细胞性淋巴瘤细胞中表达，而且在T-ALL和AL中也有50%表达PAX5。别的，Haada等7报道，运用RT-

17、PR能快速地在差异种类B细胞性肿瘤的临床标本中检测到PAX5转录。本研究起首运用了及时RT-PR比力t法的定量计谋来检测血液肿瘤细胞株中PAX5和D19的RNA相对表达量，在6个血液肿瘤细胞株中NaalaB细胞系的PAX5和D19RNA相对表达量别离为2.35%和2.52%，而T系和髓系细胞株险些不表达，这与Haada等7的研究效果相近。本研究还运用及时RT-PR来测定临床初诊和复发的儿童急性白血病骨髓细胞中PAX5RNA的表达，并以正常B和PB的单个核细胞作比拟。研究创造：在差异白血病和正常比拟中均匀PAX5RNA表达凹凸依次挨次为B-ALL组NralB组NralPB组T-ALL组AL组。由

18、此可见，在儿童急性白血病中，PAX5重要在B-ALL中表达，而T-ALL和AL中表达均极低；研究中创造部门B-ALL中PAX5RNA表达显着升高，因此可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点。别的，差异化疗阶段B-ALL的PAX5RNA表达的阐发创造：初诊化疗前组和复发组的均匀PAX5RNA表达比化疗缓解组的表达高。因此，对付ALL儿童最好应在初诊化疗前即测定PAX5RNA表达，厥后作动态不雅察，如容许以评估治疗反响，利于及时调解化疗方案。在很多B细胞特异性基因的启动子上如今已创造多种BSAP的结合位点8，此中包罗D19基因启动子上的BSAP结合位点9，通过此位点BSAP对D19表达起调治作用。D19是B细胞外貌信号传导体系的一个重要身分，它的活化启动多种细胞内信号传导途径10。本研究在用及时RT-PR研究B-ALL中PAX5RNA表达的同时，也检测了相应的D19RNA表达，经统计阐发两者之间的表达存在显着的相干性，与此前的有关研究报道6，7不甚同等，其大概的缘故原由是：研究工具差异，此前的报道重要是淋巴瘤，且研究标本量少；本研究工具那么为B-ALL，标本量相对较多；研究要领差异，此