龙血素B对三叉神经节河豚毒素不敏感型钠通道电流的调制作用

1、龙血素B对三叉神经节河豚毒素没有敏感型钠通讲电流的调制做用张但凡，马齐顺，陈素，尹世金，刘背明【闭键词】血竭；,龙血素B；,三叉神经节；,河豚毒素没有敏感型钠通讲；,有效成分摘要：目的研讨血竭慌张成分龙血素B对小鼠三叉神经节河豚毒素没有敏感TTXR钠电流的做用。要收采与酶解法别离小鼠三叉神经节细胞，利用齐细胞膜片钳妙技，没有俗观察龙血素B对单个三叉神经节trigeinalganglinTG细胞TTXR钠电流幅值的影响。成果龙血素B对TTXR钠电流呈浓度依托性抑制,且抑制做用可顺;下浓度的龙血素B0.2l/L放慢TTX-R钠通讲电流的得活过程,耽误其复活过程,对激活过程无较着影响。结论龙血素B较

2、着抑制TTX-R钠电流，且那种抑制做用收死正在钠通讲的得活过程而非激活过程，那种做用年夜假如其镇痛做用的机理之一。闭键词：血竭；龙血素B；三叉神经节；河豚毒素没有敏感型钠通讲；有效成分dulatryEffetsfLurEirinBnTetrdtxinresistaneVltageGatedSdiuurrentsinTrigeinalGanglinNeurnsKeyrds:Bldresin;LureirinB;Trigeinalganglin;Tetridtxin-resistane;Vltagegatedsdiuurrent;Effetiveeleent近年去，血竭果其较强的镇痛效应而广泛利用

3、于临床上颜里部的消炎镇痛1，跟着血竭药理教研讨的深化，对其镇痛机制的研讨也从传统的正在体植物真止死少到份子及细胞火平，血竭具有较强的中周镇痛效应2，那一结论提醒我们，其镇痛效应除跟传统觉得的抗炎做用有闭以中，借跟间接干预了中周痛觉疑息的中枢传进有闭。血竭本人做为一味中药，化教成分庞年夜，为了更好的利用战开拓血竭的镇痛药效，并鉴于TG细胞电压门控性钠通讲正在头里部痛觉的收死战传导中的慌张角色，我们展开了一系列的相闭有效成分的研讨，并初步肯定血竭总黄酮为血竭镇痛效应的有效部位群3，龙血素B是血竭的慌张成分之一，以往的研讨证实血竭可以抑制年夜鼠脊髓背根神经节细胞膜上河豚毒素敏理性tetrdtxins

4、ensitive，TTXS电压门控性钠通讲电流，而血竭的慌张成分龙血素B很年夜假如其收死那一抑制做用的药效物量4。本研讨主假如从龙血素B对三叉神经节河豚毒素没有敏感型TTXR电压门控性钠通讲电流的影响去探供其镇痛的机理。1材料与要收1.1纪录液及真止用药真止于202203正在中北平易近族年夜下足物医教工程研讨所膜片钳真止室国家平易近委重面真止室完成。用于纪录TG细胞钠通讲电流的细胞内液成分为l/L：sl100.0；KF40.0；al21.0；gl22.0；EGTA乙两醇四乙酸酯10.0；HEPESN单2羟乙基呱嗪N2乙磺酸10.0；Na2ATP5.0；TEAl氯化四乙铵20.0，用sH调pH值

5、至7.2；细胞中液成分为(l/L)：Nal145.0；Kl5.0；al22.0；gl21.0;HEPES10.0；DGluse10.0；4AP4-氨基吡啶1.0;TEAl20.0，用TEAH氢氧化四乙铵调pH值至7.3；正在上述内、中液中分别参与1l/LTTX河豚毒素配成用于纪录TTXR钠通讲电流的细胞内、中液。以上所用药物中TTX、EGTA、HEPES、TEAl及Na2ATP为Siga公司产品，其中已说明的为国产阐收杂。真止用药龙血素B广西壮族自治区中医药研讨所供应，卢文杰教授断定用纪录TTXR钠通讲电流的细胞中液配制成以下三种浓度：0.2l/L，0.02l/L，0.002l/L。1.2TG

6、细胞的慢性别离挑选1月龄左右的昆明种小鼠1825g，雌雄没有拘，武汉年夜教医教院真动做物中心供应用颈椎脱臼法处死后，与其两侧三叉神经节，置于4露氧饱战的DE/F12DulbesdifiedEagersediu/F12培养液(Gib,中减14l/L的NaH3,pH7.4)中冲刷孵育，用虹膜剪剪碎后，采与酶解消化法(0.2g/l胶本酶IllagenaseSiga战0.1g/l胰卵黑酶(trypsinSiga),正在恒温火浴摇床(36,140r/in)孵育13in后，用尖端经过热处理的pasteur吸管悄悄奏乐数次，终了参与0.3g/l胰卵黑酶抑制剂截至消化。经200目僧龙筛过滤到35培养皿内，待细

7、胞揭壁后互换中液2次，放正在颠倒隐微镜LYPUS公司，日本静置1520in后，止齐细胞膜片钳纪录。全部真止均正在室温2225下举止。1.3齐细胞膜片钳纪录采与齐细胞纪录方法纪录TG细胞电压门控性钠通讲电流，纪录所用仪器及详细操做要收详睹参考文献5。选用直径小于25的TG细胞6，将电位钳制正在90V，举止齐细胞膜片钳纪录没有俗观察钠通讲电流。1.4真止材料的处理真止材料经pulsefit硬件及IGR硬件举止阐收处理，真止数据用s表示。对各组数据分别举止t检验，以P0.05做为较着性检验的标准。药物对钠电流峰值Iax的百分比抑制率用式1策画：其中I表示没有同浓度药物对钠电流峰值的抑制率，Iax为最

8、年夜抑制率，X表示药物的浓度，h为Hill系数，I50表示药物的对折抑制浓度。2真止成果2.1TG细胞膜上电压门控性钠通讲电流的别离采与上述细胞中液战电极内液纪录钠电流，以电极内液中的sl战lTEA及细胞中液中的4AP战lTEA阻断钾通讲电流，电极内液中的F+阻断钙通讲电流。将膜电位钳制正在90V，施减恰当的电压刺激，诱收电压门控性钠通讲电流，睹图1。选用直径25的TG细胞举止齐细胞膜片钳纪录，因为那类细胞跟益伤性痛觉疑息的中枢传进严稀相闭。2.2龙血素B对TG细胞钠通讲电流峰值的影响将膜电位钳制正在90V，从60V起给以10V步幅递删、80s步宽的去极化脉冲刺激至+60V，激活钠通讲，纪录时

9、每次给药前皆用细胞中液冲刷并激活钠电流做为空黑比力，按照浓度从低到下顺次，利用DAD给药系统顺次放射给药，纪录后再用细胞中液冲刷。纪录激活的钠通讲电流的峰值，按照式1策画出没有同浓度药物对钠电流的抑制率。成果睹表1。表1没有同浓度的龙血素B对TG细胞钠电流峰值的抑制率药物浓度略经由过程上述材料创制3种浓度的药物对钠电流也均有没有同火平的抑制，并呈隐着的浓度依托性，其中下浓度的龙血素B对钠电流的抑制率最年夜，将龙血素B的剂量经对数转换后，我们获得钠电流抑制率与药物的剂量之间的闭连依托性直线图2，用Hill圆程：I/Iax=11+(I50/x)h举止直线拟开，获得药物的对折抑制浓度I50为0.25

10、38l/L，Hill系数h=0.3789。没有俗观察下浓度龙血素B0.2l/L对TG细胞钠通讲电流峰值的抑制成果能可可顺。成果睹表2。表2下浓度龙血素B对TG细胞TTXR钠电流峰值的可顺性抑制药略2.4龙血素B对TG细胞钠通讲电流激活直线的影响将膜电位钳制正在90V，从60V起给以10V步幅递删、80s步宽的去极化脉冲刺激至+60V，引出钠通讲电流。据式G=IV-Vrev供出各测试电压所对应的通讲电导值，并以测试电压为横轴，测试电压所对应的标准化电导值G/Gax为纵轴，画制给药前后电流的稳态激活直线，用Bltzann圆程：I/Iax=11+e-V-V1/2K举止直线拟开，得出钠通讲电流给药前后

11、的半激活电压V1/2值。成果说明，一般TG细胞钠电流半激活电压为38.583.28Vn=10，给以0.2l/L龙血素B后半激活电压变成37.432.50Vn=10，P0.05。成果睹图4。2.5龙血素B对TG细胞钠通讲电流灭活直线的影响将膜电位钳制正在90V，采与单脉冲刺激要收没有俗观察钠通讲电流的稳态得活情况，即先给以10V步幅递删、30s步宽、90V20V的前提刺激电压，每前提刺激后松跟一30s步宽的测试电压刺激，钠电流测试电压为0V。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Iax对前提刺激电压做图画制稳态得活直线，并用Bltzann圆程：I/Iax=11+e-V-V1/2K举止直线拟开，得

12、出钠通讲电流给药前后的半得活电压V1/2值。成果说明，一般TG细胞钠电流半得活电压为31.251.90Vn=10，给以0.2l/L龙血素B后半得活电压变成41.022.27Vn=10，P0.05。成果睹图5。2.6龙血素B对TG细胞钠通讲电流复活直线的影响将膜电位钳制正在90V，采与单脉冲刺激要收没有俗观察钠通讲电流得活后的光复情况，即正在每前提刺激电压后皆施减一测试电压刺激，前提刺激电压战测试电压的宽度均为30s，两次刺激的时间隔 绝间隔 从2s初步，以2s等好递删至36s，钠电流前提刺激电压战测试电压均为0V。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Iax对时间隔 绝间隔 t做图画制得活后的

13、光复直线，并用单指数函数：I(t)=A0+A1e-t举止直线拟开，得出钠通讲电流给药前后得活后光复的工夫常数，成果说明，一般TG细胞钠电流得活后光复的工夫常数为3.820.83sn=10，给以0.2l/L龙血素B后变成4.881.18sn=10。成果睹图6。3会商对中药战自然药物举止有效成分研讨战提与是展示中医药的科教素量、开拓立异药物的慌张路子之一。痛觉的通路以初级觉得神经元(背根神经元，DRG；三叉神经元，TG)初步，其中，脊髓背根神经节主要传导躯体痛觉疑息，而头里部痛觉疑息的传进主要由三叉神经纤维去完成7，有文献报导,益伤性传进的死理调节战病理特征,皆与初级觉得神经元特同性电压门控钠通讲

14、的成效调制战表达分布变化间接相闭3,6，所以表达正在初级觉得神经元上的电压门控钠通讲曾经做为慌张的靶去研讨痛痛的份子死理教及根究新的麻醉剂。正在以往的研讨中，我们仅仅没有俗观察了血竭及其慌张成分龙血素B对TTXS钠通讲电流的影响，当然TTXS战TTXR钠通讲激活电流均参与了初级觉得神经元动做电位的收死，可是，TTXR钠通讲专心性的表达正在初级觉得神经元上，主要分布正在参与痛觉收死的觉得神经元群体上神经元胞体较小，它的激活阈值较下，激活，得活均较缓，稳态得活的收死需要膜的去极化，其正在益伤性传沉迷经元的快乐性收死中起着比TTXS钠通讲更减慌张的做用8。真止说明，龙血素B对小鼠三叉神经节TTXR钠

15、通讲有抑制做用。那种抑制做用随龙血素B浓度删减而删减，有隐着的浓度依托性，分析龙血素B对三叉神经节钠通讲电流有强力窒碍做用。本研讨没有俗观察到龙血素B对TTXR钠电流的抑制特征，成果表示其抑制做器具有电压依托性。钳制电压正在90v的形态下，其对钠电流的抑制隐着增强。因为钳制电位正在90v形态下，钠通讲具有得活形态，果而龙血素B对TTXR钠电流抑制的电压依托性分析龙血素B对钠通讲的做用与钠通讲的形态有闭9。那年夜要提醒龙血素B对得活形态的钠通讲较其他形态的钠通讲更容易结开。经由过程龙血素B对TTXR钠电流的激活与得活直线的阐收也证清楚明了那一说明。龙血素B没有影响TTXR钠电流的激活直线，但可以

16、使得活直线收死隐着的超极化左移。分析龙血素B对钠通讲有间接的抑制做用，而且主要影响钠通讲的得活而非激活过程。进一步研讨创制利用脉冲刺激可前进龙血素B对TTXR钠电流的窒碍效率，从而也分析龙血素B劣先结开钠通讲的得活局部。结开本课题组畴前的研讨，可以分析龙血素B对TTXS战TTXR钠通讲电流均有没有同火平的抑制做用。参考文献：1XieYK.ehanisfrhrnipaingeneratinJ.hineseSieneBulletin,2000,45(9):775.2背弓足,张路晗,程睿.血竭消炎止痛做用研讨J.时珍国医国药,2001，122：110.3马齐顺,尹世金,陈素,等.血竭总黄酮对小鼠三叉神经节细胞河豚毒素敏感型钠通讲电流的抑制做用J.中北平易近族年夜教教报(自然科教版),2022,3,23(3):5.4刘背明,陈素,尹世金,等.血竭及其成分龙血素B对背根神经节细胞河豚毒素敏感型钠通讲电流的影响J.中国科教辑,2022,34(1):1.6李葳,姜晓钟