生物物理技术-1课件

1、生物物理技术分子荧光光谱技术分子振动光谱技术核磁共振波谱技术X射线晶体衍射技术各种显微镜技术细胞膜片钳技术生物物理技术的最新进展荧光光谱技术Spectrophotofluorimetry一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱 三、荧光光谱仪及主要谱参量四、荧光生色团的结构特点五、影响荧光测量的因素六、荧光光谱技术在生物医学中的应用七、GFP荧光蛋白（一） 荧光的产生（二）荧光光谱与吸收光谱二、荧光与荧光光谱（一） 荧光的产生1、分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er Ee：价电子运动能, electron Ev：原子在平衡位置附近的振动,vibration Er

2、：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，Ee Ev Er基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2.表示。三重态能级低于单重态（Hund规则）（二）荧光光谱与吸收光谱荧光光谱术： 又称荧光分光光度术，属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。（一）荧光光谱仪凡是用于研究光的吸

3、收、发射和散射的强度与波长关系的仪器，均称之为光谱仪或分光光度计。这些仪器通常都是由光源、单色器、样品室、检测器和显示器等5个基本单元组成。氢灯的能量分布氘灯的能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布1、激发光源 在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯，氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。对于光源要注意以下几点:（1）正负极不要接错。（2） 拿灯时，不要碰窗口，以免手上的“油污”经紫外照射后，难以清除。 应及时用无水乙醇擦干净。（3） 灯有寿命，要节约使用。（4） 启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。 启动后要预热 半小时。

4、（5） 不要用眼睛直视灯。2、样品池在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。（1）设置空白对照 。 （2）清洗问题，关键是即时冲洗。自来水冲洗SDS浸泡双蒸水冲洗浓硝酸处理双蒸水冲洗（二）荧光分光光度术中的参量exMaximum excitation wavelength em, max Maximum emission wavelength1） 荧光强度的定义：在一定激发波长(ex)作用下，发射的荧光强弱。 F=Ia 2） =发射光子数/吸收光子数 2、荧光强度（fluorescence intensity, F, I ）与量子产率（quantum yield, ）Lambert-Beer

5、定律：Ia=I0-I，I=I010-cL F = I0(1-10-cL ) 当C很低时F= I0cL ， 当C较大时F=I0 为吸收系数或消光系数荧光强度与浓度的关系、荧光偏振( fluorescence polarization)（二）荧光分光光度术中的参量自然光 部分偏振光 偏振光荧光(1) 荧光偏振度的物理意义：A ：I/=I ，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取向随机。（稀溶液中的荧光分子）B：I/或I为0 ，P=1，平面偏振光，荧光分子运动很慢或取向有序的情况。C： I/I 0 ，0P1，生物大分子的荧光属于这种情况。(2) 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响 A .温度的影响：

6、溶液粘度A：温度的影响温度升高，P降低B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的运动转动旋转弛豫时间rotational relaxation time 5、荧光探针具有环状共轭双键即电子系统量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein（395nm，509nm）(4) 与研究对象的特定基团共价结合，或与蛋白质非共价结合（5）荧光探针的应用分类 测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针， 其它非极性和双亲性膜探

7、针。细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 Ca2， Mg2， Zn2 ，Na， K， Cl等离子荧光探针 pH荧光探针: 近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物 活性氧和一氧化氮探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针pH 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂 细胞骨架蛋白荧光探针 四、荧光生色团的结构特点1、天然荧光生色团的结构特点（1）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。（2）分子的几何排布： 具有刚性平面结

8、构 荧光素酚酞（4）取代基的位置： 邻位、对位荧光增强，间位荧光减弱（-CN基例 外）（5）环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光（3）取代基的类型： 1）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 2）减弱荧光的基团：得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I 3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH32、蛋白质和核酸中的荧光生色团色氨酸Tryptophan(W, Trp)苯丙氨酸Phenylalanine(F, Phe)酪氨酸Tyrosine(Y

9、, Tyr)四、荧光生色团的结构特点生色团条件exnmmax10-3emnmFFns敏感度maxF 10-2TrpH2O, pH72805.63480.22.611TyrH2O, pH72741.43030.13.61.4PheH2O, pH72570.22820.046.40.08Y-base二氢尿嘧啶 Yeast t-RNAPhe3201.34600.076.30.91亚硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+ pH5.8)+Phe ex: 460nm, em: 570nmex: 365nm, em: 515nm五、影响荧光测量的因素1、光分解（photodissociation） 光照后导致化学

10、键断裂荧光减弱 光漂白2、淬灭(quenching) (1)温度淬灭： 温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。 (2)浓度淬灭：内滤光效应（inner filter effect) (3)杂质淬灭：3O2 1O23、溶液pH的影响利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。指示剂颜色变化pH范围萘 酚无色变黄绿8.2-10.3荧光素浅绿变绿4.0-5.0丫啶橙浅黄绿变黄8.0-10.04、溶液极性的影响荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向（或高频方向）移动，即蓝移，同时

11、荧光强度前者也高于后者。(膜探针)：，二苯基，己三烯水溶液中膜 中发射波长：440nm发射波长：430nm5、溶剂和化学试剂(1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2) 溶剂要纯6、荧光污染(1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞(2) 去污剂(3) 微生物污染(4) 滤纸六、荧光光谱技术的应用(一) 物质的检测 1、测量原理： 稀溶液， F= I0cL 2、结构特点：含有“芳香环”结构 3、灵敏度：10-710-8g/ml检测物质激发波长nm发射波长nm维生素A345490维生素B2，pH7370565维生素B12， pH7275305维生素C4905303,4-苯并

12、芘10-6g/ml3814035-羟色胺，中性或弱酸性2953305-羟色胺，盐酸295550，330研究生物大分子构象 （二）蛋白质的荧光分析1、蛋白质的内源荧光2、蛋白质的外源荧光（1-苯胺基萘-8-磺酸盐） GdnHCl盐酸胍（三）核酸的荧光分析1、嘌呤及衍生物室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。碱性介质中，鸟嘌呤有荧光2、嘧啶及衍生物游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低0.00153、核酸的荧光标记Probes exemNoteEthidium Bromide（溴乙啶）545610非透膜，RNA,DNAPropidium Iodine

13、（碘化丙啶 ）530615PO-PRO-1 iodine435455Acridine Orange（吖啶橙 ）490590透膜，RNA,DNAPyronin Y（派洛宁 Y）545580Bisbenzimide（双苯酰亚胺 ）345460透膜，DNA（四） 利用荧光技术检测分子间结合程度1、用荧光偏振变化检测结合程度当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变其荧光特性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结合时的信息。结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。用杀鼠灵滴定人血清白蛋白(HAS) r= L Ka (n - r) L = L0 LP = L0 rP0ex=

14、320nm em=400nm2、用荧光强度变化检测结合程度r为每个生物分子结合的荧光分子数，L为游离的荧光分子浓度，Ka为每一位点固有的结合常数，n为r的最大值。Scatchard方程： Scatchard图r= a/b（五） 大分子内基团间或分子间距离的测定荧光共振能量转移( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)S*+A S+A*A+h荧光共振能量转移的三个条件：供体和受体都能发光供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠供体和受体的距离必须小于100Frster 公式:E= R06/(R6+R06)R0: 临界距离，E：转移效率，R：基团

15、间距离E= 1- IDA/ID IDA: 受体存在时的荧光强度，ID：受体不存在时的荧光强度 大分子内基团间或分子间距离的测定1、膜流动性 DPH (1,-二苯基-,-己三烯)：偏振度P值小，流动性高 2、膜渗漏性 羧基荧光素：浓度高时自淬灭（脂质体中），释放到溶液中稀释后发荧光。 3、膜电位的测量：利用荧光强度随电位变化而变化 荧光探剂：花菁（cyanine)带正电 如：K+载体（缬氨霉素）Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+) KO+：细胞外浓度， KI+：细胞内浓度（六） 膜生物物理研究4、膜融合机理的研究方法一 ：利用能量共振转移现象II方法二：利用淬灭现象1/25

16、、膜成分扩散速度的测定荧光漂白恢复技术fluorescence recovery after photobleaching，FRAPD：扩散系数，：光斑半径， 1/2：漂白后的荧光值恢复到稳定值的一半所需时间， rD：与光斑形状有关的一个常数。常用探针：标记脂类DiI（羰花青类染料） 标记蛋白异硫氰荧光素（FITC），罗丹明（rhodamine）D=241/2rD（七） 荧光技术与其它技术的结合1、显微荧光光度术 对细胞内的不同成分进行定性、定位或定量2、流式细胞术 荧光，激光和计算机结合3、激光扫描共聚焦显微镜 4、光镊（optical tweezers)Fluo-3/Ca2+，AM, ex

17、=506nm, em=526nm七、GFP荧光蛋白It all started with GFP (Green Fluorescent Protein)Naturally produced in Jellyfish Aequorea victoriaThe first bioluminescent protein discovered in the 1960sGlows green when exposed to UV light. 2008年诺贝尔化学奖日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁查尔非 美国华裔科学家钱永健诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美

18、籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。2008年诺贝尔化学奖下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿色。马丁查尔菲 ：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为现实。GFP的结构特点一级结构GFP由238个氨基酸残基组成，分子量为26.9kDGFP的生色团位于氨基酸序列6469位GFP的第65、66、67位氨基酸分别是

19、丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核心GFP的结构特点空间结构特点：由 11 条桶状结构(- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约3nm，长约4nm。一条螺旋缠绕在圆柱体的轴位置生色团附着在螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心这种方式被称为罐 (-can)晶体结构GFP的发光机理GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。实质：由第65、66、67位的丝氨酸脱氢酪氨酸甘氨酸形成对羟苯甲基咪唑环酮GFP的荧光特性GFP的最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光)尽管450490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量

20、低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测。GFP的荧光特性GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。 GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强，特别在450490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP的荧光特性 通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。项目激发峰发射峰野生型（wt-GFP）红移突变体RSGFP黄绿突变体YGFP蓝色突变体BFP增强型突变体OGFP半衰期短的突变体395471-490513385385488509502-511527