分子生物学第五章：基因表达调控真核生物课件

1、 第五章 基因表达的调控 主讲教师:刘 静 中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心 多细胞真核生物，遗传信息从细胞核的基因组DNA传递到基因编码的蛋白质均受到多层次的调控。第二节 真核生物基因表达的调控 一、真核生物基因表达的特点 1.细胞具有全能性 全能性：指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组DNA，都有发育成完整个体的潜能。 2.基因表达的时间性和空间性 时间性：个体发育的不同阶段，基因表达的种类和数量是不同的；空间性：在不同组织和器官中，基因表达的种类和数量是不同的。13.转录和翻译分开进行 真核生物DNA在核中转录生成 mRNA，穿过核膜至胞质指导蛋白质合成；转录和翻译不是同

2、步进行的，受多层次调控。 4.初级转录产物要经过转录后加工修饰 初级转录产物为核不均一RNA （heterogeneous nuclear RNA , hnRNA）5.不存在超基因式操纵子结构 真核生物基因转录产物为单顺反子。6.部分基因多拷贝 某些基因以多拷贝形式存在，如组蛋白和 tRNA等，这样既可满足细胞的需要，也是表达调控的一种有效方式。translationtranscriptionmRNADNAProteinPromoterGene35单顺反子mRNA (monocistronic mRNA) （一）基因组DNA水平的调控 1.染色质的丢失 不可逆的调控。 线虫 胚胎期：1090个

3、细胞 成 虫：959个细胞 131个细胞在发育过程中发生凋亡 二、真核生物基因表达的调控机制 3.基因重排（gene rearrangement）VJ C V JCVJ C 免疫球蛋白IgG基因许多片段发生重排，为免疫球蛋白分子的多样性奠定了基础 指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。BCR-ABL融合基因形成示意图(140 kDa)(160 kDa)4.基因的甲基化修饰 DNA上特定的CpG序列处的胞嘧啶发生甲基化修饰（5mC）。甲基化程度与基因的表达一般呈反比关系。甲基化程度愈高，基因的表达则降低。去甲基化，基因的表达增加。GCGCGCG

4、CGene 5.染色质结构对基因表达的调控作用 组蛋白与DNA结合与解离是真核基因表达调控的重要机制之一。 非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。 常染色质中疏松状态的活性染色质是基因转录前在染色质水平上独特的调控机制。1.转录起始复合物的形成2.顺式作用元件 (cis-acting element)3.反式作用因子 (trans-acting factor)4.转录水平的调控机制 （二）真核生物基因转录调控 以RNA聚合酶为例 2. 顺式作用元件(cis-acting element) 指某些能影响基因表达但不编码新的蛋白质和RNA的DNA序列，按照功能分为启动子、增强子、负调控元件（沉

5、默子等）。 （ 1）启动子(promoter) 在基因转录起始位点(+1)及其5上游近端大约100200 bp 以内的一组具有独立功能的DNA序列。每个元件长度约为720 bp，是决定RNA聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件。 真核类基因的顺式作用元件图 核心启动子(core promoter) 包括“转录起始位点”及其上游-25-30 bp 处富含TA的典型元件“TATA”盒。核心序列为TATAAAA，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。上游启动子元件( upstream promoter element, UPE)包括通常位于-70 bp 附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(

6、GGGCGG），功能：调节转录起始的频率，提高转录效率。 （2） 增强子(enhancer) 位于启动子上游或下游并通过启动子增强邻近基因转录效率的DNA顺序，增强子本身不具备启动子活性。 (3) 其他元件 包括负调控元件和终止子等。 负调控元件: 沉默子（silencer） 或衰减子（dehancer） 真核基因内能抑制基因转录的DNA序列，与反式作用因子相互结合而起作用。不受距离和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。终止子 在模板DNA分子的5端转录终止信号。通常具有po1yA尾的基因终止信号为GT簇，例如在SV40中的AGGTTTTTT序列为终止转录调控元件。 （1）反式作用因子根据

7、作用方式分为三类： 通用转录因子。普遍存在的转录因子。如TATA box结合因子 TFD、GC box结合因子SP1 等。组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性有很大关系。诱导性反式作用因子。活性能被特异的诱导因子所诱导。（2）转录因子(transcription factor，TF ) RNA合成起始所必需的因子。TF不依赖RNA聚合酶而独立地结合DNA，在转录过程中促使许多RNA聚合酶分子与启动子结合。 TFA结构域示意图TFA肽链的指结构域含有9个指，与相应的DNA序列结合，指“尖”可以进入DNA双螺旋的大沟或小沟。但羧基端不具有指结构，是RNA聚合酶和其它的转录因子相互作用的部位。

8、 TATA因子与TATA盒结合，形成稳定的转录复合物，介导RNA聚合酶分子转录。 真核基因开放的转录起始复合物的形成图RNA聚合酶识别并结合以上蛋白质-DNA复合物。形成闭合复合物，DNA双链没有打开，不能启动转录。转录起始因子与RNA聚合酶结合，使DNA部分双螺旋解开成为开放的转录起始复合物，转录开始合成RNA。DNA识别结合域： 锌指（zinc finger）结构 ACys2His2锌指结构； B折叠的Cys2His2锌指结构；CCys2Cys2锌指结构同源结构域（homeodomain，HD） 同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序列。所含的至少二个螺旋中形成“转折”，第三个螺旋与DN

9、A大沟相互作用，是同源盒蛋白与DNA结合的主要力量 。碱性-亮氨酸拉链亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链” 。肽链氨基端2030个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。DNA结合部位结构域疏水性亲水性亲水性螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH） 含两个双性-螺旋，每34个氨基酸含一个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋的氨基酸残基。酸性-螺旋（acidic -helix domain） 能非特异性地与起始复合物（如TATA盒结合因子）相互作用发挥转录活化功能。富含谷氨酰胺的结构域（glutamine-rich domain） 最强的转录活化域之一。富含脯

10、氨酸结构域（proline-rich domain） 2)转录活化结构域 （transcriptional activation domain）3.转录水平的调控机制()反式作用因子的活性调节 真核基因转录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。反式作用因子的激活方式:表达式调节共价修饰 A.磷酸化去磷酸化。 B.糖基化。配体结合 ：(核受体超家族)蛋白质与蛋白质相互作用（2）反式作用因子作用方式 1）成环（looping）2）扭曲(twisting)3）滑动(sliding)4）Oozing 反式作用因子与顺式元件结合如何影响到远距

11、离RNA聚合酶结合并影响其调控基因？ （3）反式作用因子的组合式调控基因表达的调控不是由单一的反式作用因子完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。1（1）报道基因分析法原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达质粒中,再转染细胞,通过报道基因的活性可检测转录活性。应用：启动子活性的检测常用的报道基因：Luciferase （荧光素酶）、 GFP（绿色荧光蛋白）、 SEAP（分泌性碱性磷酸酶）4.转录水平研究方法1（2）DNase超敏感分析法原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经DNase消化常出现长短不均一的100200 bp 的DNA片段，说明此 DNA 受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对

12、DNase高敏感点(hypersensitive site)。方法：用 DNase处理细胞核DNA，再用合适的内切酶进行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行southern 杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。应用：确定基因启动子内调控区的位置。1（3）足纹法（foot printing)原理：蛋白质结合到DNA序列上，可阻止核酸酶对其的降解。方法：DNA序列与靶蛋白进行孵育，再用DNase进行切割，电泳，分析图谱。应用：确定DNA结合蛋白的识别序列。1（4）凝胶迁移率（gel shift assay) 或电泳迁移率实验（EMSA） 原理：蛋白质与特定的DNA序列结合后，迁移率会发生改

13、变， DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。方法：纯化的蛋白或细胞粗提液和同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，聚丙烯凝胶电泳，放射自显影。 应用：研究DNA结合蛋白；RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。(三)转录后水平的调控1. 5端加帽和3端多聚腺苷酸化及意义 5端加帽:真核生物转录生成的mRNA在转录后，在5端加上7甲基鸟苷 (m7GPPPmNp-)。 意义:保护转录体mRNA不受5外切酶降解，增强mRNA稳定性，有利于mRNA从细胞核向胞质转运，促进mRNA与核糖体结合（通过帽结合蛋白介导完成）。 3端加尾:转录后在mRNA在3末端加上50150个腺苷酸，即p

14、oly(A)尾。意义:保证mRNA在转录过程中不被降解。2. mRNA前体的选择性剪接(alternative splicing)对基因表达的调控作用 （1）mRNA前体的剪接 真核细胞基因表达所转录出的mRNA前体在剪接酶作用下，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成成熟的mRNA，这一过程即为剪接。 高等真核细胞中，某个内含子5的供点在特定条件下可与另一个内含子3受点进行剪接，同时删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含子，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的。 （2）mRNA的选择性剪接 外显子选择：保留或部分保留外显子内含子选择：删除或部分删除内含子互斥外显子：两个外显子不能同时存 在于同一成熟mRNA中内部剪接位点：内含子部分切除或外 显子部分保留 意义:在高等生物细胞的高度异质性中起重要作用。由于剪接的多样化，一个基因在转录后通过mRNA前体的剪接加工而产生两个或更多的蛋白质。 mRNA的选择性剪接1CBACy5-标记cDNACy3-标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品1样品2Cy5/Cy3荧光标记RNA提取竞争性杂交显示基因表达量差异二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯