分子荧光分析法1 (1)课件

1、荧光及荧光分析 荧光及荧光分析概述基本原理荧光分析仪器与技术应用与示例光学光谱区远紫外近紫外可见光近红外中红外 远红外（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m 什么是荧光 ？ 荧光基础理论当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就会发射出波长和强度各不相同的光线，停止照射光照射时，这种光线马上或逐渐消失，这就是荧光。荧光的发现及发展 1575年，西班牙医生N. Monardes首先发现荧光 1852年，Stokes发现荧光波长比照射光波长 要长，认定荧光是发射光。 1867年，首次用于分析测定。

2、 1952年，商品荧光分光光度计出现。 2008年，日本村修、美国马丁沙尔菲、美籍 华裔钱永健因发现并发展了绿色荧光蛋白质技 术而获诺贝尔化学奖。 分子发光的类型分子发光的类型可以按两种不同的办法加以分类,其中一种以激发的模式加以分类,另一种是按分子激发态的类型来分类. 按分子激发态的类型可分为荧光和磷光,荧光:由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象.磷光:由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象. 按激发模式分类,可分为:a.光致发光:分子因吸收外来辐射的光子能量被激发所产生的发光.b.化学发光:分子的激发能量是由反应的化学能提供.c.生物发光:分子的激发能量是由

3、生物体释放出来的能量提供.d.热致发光:由热活化的离子复合激发模式所引起的发光现象.e.场致发光:由电荷注入激发模式所产生的发光.f.摩擦发光:由摩擦激发模式所产生的发光.基态单重态激发单重态激发三重态区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。电子跃迁类型允许跃迁禁阻跃迁S0S1, S2, S3T1, T2, T3 在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。 电子跃迁类型激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性激发

4、态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。电子跃迁 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无 辐射跃迁方式再回到基态。 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发 射； 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能 量，包括振动弛豫（VR）、内转移（IR）、外 转移（EC）及系间窜越（ISC）等，各种跃迁方 式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。分子的去激发无辐射跃迁辐射跃迁荧光（F）磷光（P）振动弛豫内转移外转移体系间跨越分子的去激发辐射跃迁荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能

5、级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106109s-1。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 10s。在光照停止后，仍可持续一段时间。内转换 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。无辐射跃迁外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振

6、动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。无辐射跃迁系间窜越指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1T1就是一种体系间跨跃。通常，发生体系间跨跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。无辐射跃迁hvAhvFS1T1S0hvP荧光产生的基本原理内转换（Internal Conversion，IC）: 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠

7、的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）:系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。荧光:分子电子从单重激发态的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。磷光: 分子电子从三重态最低振动能层，跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨

8、越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫5）荧光发射 分子电子从单重激发态（Kasha规则）的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效应）。6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。(2).迟滞荧光 物质分子在刚性或粘稠介质中,除了磷光谱外,还可能观察到另一种长寿命的发射谱带,但这个发射谱带波长比磷光谱

9、带波长要短.往往把这种长寿命发射的谱带称为迟滞荧光.迟滞荧光分为E-型迟滞荧光,P-型迟滞荧光和复合荧光三种类型.E-型迟滞荧光:处于T1电子态的分子,经热活化提高能量后而处于S1电子能态,然后自S1电子态辐射跃迁产生荧光.P-型迟滞荧光: 这类荧光,其S1电子激发分子的布居,是由两个处于T1电子态的分子相互作用时所引起的,此过程称为“三重态-三重态粒子湮(yan)没”,结果产生一个激发单重态分子.复合荧光其第一电子激发单重态分子的布居，是由自由基离子和电子复合或具有相反电荷的两个自由基离子复合引起的。.斯托克斯（stokes)荧光 在溶液中观察到的荧光,其发射的荧光比激发光的波长要长.激发光

10、荧光分子碰撞引起的能量损失S0S1.反斯托克斯荧光（antistokes) 如果在吸收光子的过程又附加热能给予激发态分子,则发射的荧光波长比激发光的波长短.这种荧光可在高温的稀薄气体中观察到.激发光荧光吸收热能S0S1.共振荧光 与激发光具有相同波长的荧光,这类荧光在气体和结晶才有可能发生. 激发光荧光S0S1荧光的检测单色器光源检测器狭缝单色器吸收池狭缝I0It荧光测量荧光的检测 光谱特征 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。1）激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光

11、谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。2）发射光谱发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。 由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。激发光谱和发射光谱 由于分子对光的选择性吸收,不同波长的入射光便具有不同的激发效率.如果固定荧光的发射波长(即测定波长,不断改变激发光(入射光)的波长,并记录相应的荧光强度.所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱.

12、如果使激发光的波长和强度保持不变,而不断改变荧光的测定波长(发射波长)并记录相应的荧光强度,所得到的荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱. 由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。如右图所示。i）波长比较 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致）ii）形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激后可到达不同能层的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。 换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的

13、各个振动能层。激发光谱与发射光谱的关系温州大学化材学院微纳结构材料 & 物理化学研究所iii）镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系S04321S14321 荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。 吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。 由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。解释1：能层结构相似性荧光寿命和荧光量子产率荧光寿命和荧光量子产率F1和F2分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；F1和F2分别表示待测物质和参

14、比物质的积分荧光强度；A1和A2分别表示待测物质和参比物质在激发波长下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的荧光量子产率为0.55,是测量荧光量子产率时经常使用的一种参照物.)荧光量子产率的测量方法分子结构与荧光的关系 产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）； ii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。即量子效率 F足够大：=kf/(kf+K)分子结构与荧光1）跃迁类型： 通常，具有*及n*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具*跃迁的荧光效率比 n*跃迁的要大得多。2）共轭效应： 共轭度越大，荧光越强。共轭结构与荧光的关系提高共轭度有利于

15、增加荧光效率并产生红移。分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素（ 大）与酚酞（=0）；分子结构与荧光刚性结构和共平面性与荧光的关系8 羟基喹啉8 羟基喹啉镁形成络合物后,形成刚性平面刚性结构和共平面性与荧光的关系7 - 二甲胺萘 1 - 磺酸盐 F =0.758 - 二甲胺萘 1 - 磺酸盐 F =0.03空间位阻与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系反式结构，发光顺式结构，不发光1，2二苯乙烯空间位阻与荧光的关系分子结构与荧光4）取代基： 给电子取代基增强荧光（p-共轭），如 -OH、-

16、OR、 -NH2、-NR2等； 吸电子基降低荧光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等； 重原子降低荧光但增强磷光， 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。取代基的影响 给电子取代基 增强荧光NH2, NHR, NR2, OH, OR, 等EM285-365 nm270-310 nm310-405 nm相对荧光强度 1.8 1.0 2.0 吸电子取代基n 电子不与 电子共轭羰基类1）n* 跃迁禁阻，小，10-22）最低单重态为 n, * 型，易于ISC。荧光弱，磷光强非荧光强荧光取代基的位置1） 有利于电子离域的，则荧光增强。 因此，一般邻

17、位、对位给电子基团导致荧光增强。2）有利于形成环，导致分子刚性增大，荧光增强。荧光强度较弱荧光强度较强重原子效应重原子降低荧光但增强磷光 如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。F 0.22 10-5P 0.14 0.43P 1.9 s 0.024 s重原子效应不含有杂原子（N,O,S）的有机化合物均属于这一类，其特点是自旋允许跃迁，大，104，荧光强 , *1) 含有杂原子（N,O,S）的有机化合物多属于这一类，含有n 电子，其特点是自旋禁阻 ， 小，102, ISC速率大，荧光弱。2) n 轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成氢键等，将使n 轨道的能量

18、降低，导致n*跃迁的能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成,*。分为两类 含氮杂环有机物含羰基杂原子有机物 n, *最低单重态的性质含氮杂环有机物荧光随溶剂极性的增大而增强例1 喹啉介质 苯 乙醇 水相对荧光 1 30 1000可以理解为N上的孤对电子与水形成氢键，使n轨道能量降低，从而使最低单重激发态由n, *变成, *。含羰基有机物芳香类S1与T1能级间隙小， ISC效率高，接近于1。脂肪类有微弱的荧光，ISC效率低一些影响荧光的外界因素（一）溶剂效应： 溶剂极性可增加或降低荧光强度 （改变*及n* 跃迁的能量）； 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。影响荧光的外界因素（二

19、）温度： 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。影响荧光的外界因素（三）pH值： 具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。pH 13pH712影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸： 体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。荧光猝灭（1）碰撞熄灭荧 光 猝（熄） 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分

20、子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光猝（熄）灭剂：能引起荧光猝灭的物质称为荧光熄灭剂。相对速率 1K1 M*K2 M* Q 与分子的直径、粘度、温度等因素有关。激发发射熄灭（2） 能量转移熄灭再吸收过程：共振能量转移：分子内能量转移：hv荧光猝灭（3） 氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，没有除氧，溶液中难以观察到磷光荧光猝灭（4） 自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自吸收：由于F 1，使荧光强度减弱或消失.形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。荧光猝灭单色器单色器光源。检测器液 槽放大和指示仪表荧光分光光

21、度计的结构示意图I0I仪器结构示意图仪器与技术 荧光计的主要部件1）光源：氙灯、高压汞灯、激光；2）样品池：石英（低荧光材料）；3）两个单色器： 选择激发光单色器；分离荧光单色器；4）检测器：光电倍增管。基本装置及主要构件1、激发光源 （1）条件: 足够的强度 紫外，可见区域有连续的光谱 强度与波长无关 光强稳定（2）激发光源: 氙灯（高压）: 2501000nm光谱区呈连续光谱，使用寿命大约为2000h。 汞灯（高压）:在紫外区激发，365nm，使用寿命 15003000小时。2、单色器 光栅单色器 有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱，主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可用

22、前置滤光片加以消除。 滤光片 滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有广泛的应用。 基本装置及主要构件3、样品池 石英方形池，四面都透光。 4、狭缝 狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。 基本装置及主要构件5、检测器光电倍增管：灵敏度高，线路简单。光电摄像管：具有检测效率高，动态范围 宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。6、读出装置 记录仪、阴极示波器和显示器。基本装置及主要构件荧光定量分析光吸收定律（Lambert Beer Law）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：对于稀溶液，当 Lc0.05（磷光 Lc0.01）时：IF-荧光强度F-荧光量子产率k-与仪器灵敏度有关的参数I0-入射光强度。IP-磷光强度P-磷光量子产率b-吸收光程-摩尔吸光系数C-荧光物质浓度荧光定量分析荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之间。可 见比UV-Vis的灵敏度高得多！ 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：