复旦药学专业课课件相关专业复试看药物分析第十三章

1、 生物制品分析概论第十三章基本内容1概述 2鉴别试验3杂质检查（特殊杂质、安全性检查）4含量测定（生化方法）第一节 概 述生物药物Biopharmaceutics或Biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类物质，包括直接提取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。 生物药物的发展第一代：生物材料加工制成，如鱼肝油等；第二代：近代生化分离纯化技术，针对性治疗，特异生化成分，如尿激酶、疫苗因子等第三代：生物工程技术，活性高的类似物。如：干扰素，白细胞介素等

2、。 一、药物分类 药物 化学药物 生物药物 中药 生化药物 生物合成药物 生物制品 biopharmaceutics (biopharmaceuticals)biochemical drugsbiosynthetic drugsbiological products据来源和生产方法 1生化药物 例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。动物植物微生物 提取生物-化学半合成现代生物技术生命基本物质及衍生物、降解物、大分子的结构修饰物（1）微生物代谢所产生的药物（2）必须利用微生物及其酶转化反应共同完成的 2生物合成药物 例：山梨醇、木糖醇、氨基酸、甾体激素和核苷酸等。3生物制品 生物技术：利用自然科学和工

3、程学的原理，以植物体、微生物体和动物体作为反应器将物料进行加工提供产品的技术。传统生物技术现在生物技术如基因工程以微生物、细胞、动物或人源组织和体液为原料，利用生物技术制成的药物。现代生物技术一、现代生物技术的发展传统生物技术 应用酿造发酵、配育新种等方法来达到以上目的； 现代生物技术 以生物化学或分子生物方法改变细胞或分子的遗传性质。这是在根本上控制了生物的代谢或生理，以达到生产有用物质之目的。两种生物技术的最大差异处在于：现代生物技术是在“细胞与分子”层次用微观手法来进行操作，不同于传统生物技术产业以“整体”动物、植物或微生物的饲养、交配或筛选方式现代生物技术优点：不依赖于自然界的有限资源

4、，而是按照人类的需要，以全新的途径来生产和创造各种生物产品。主要包括发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程等。 (一)发酵工程 利用生物细胞的某种特定功能（本身具有或经遗传性状改造），给其提供最适宜的生长条件，通过现代化工程技术手段，生产出人类需要的产品的技术和工艺。 目前利用发酵工程达到生产规模的生化药物有氨基酸、多肽、蛋白质、酶、核苷酸、抗生素、维生素、生物碱、细胞毒素、激素、有机酸、糖和脂类等。 发酵技术上游处理过程（菌种、培养基和生长条件选择）发酵和转化（微生物的大量生长反应器中进行）下游处理产品（目的产物的纯化）(二)酶工程 将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置

5、中，提取有用的酶形成产品或者利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用的一种技术。 特点：反应特异性高，收率高，副反应和副产品少，反应容易控制。包括酶制剂、固定化酶、酶反应器等。 生物反应器：指将生物物质(如微生物、酶、细胞等)和反应设备结合在一起的一种装置。目前有活细胞反应器、游离酶反应器、固定化酶和固定化细胞反应器、细胞培养装置等，其中固定化酶反应器有较大发展前途。 利用酶工程进行氨基酸的酶转化、甾体的生物转化、抗生素的半合成、辅酶的再生等均取得了较好效果。 生物制药工艺流程图(三)细胞工程 定义：细胞工程就是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物

6、进行修饰，为人类提供优良品种、产品和保存珍贵物种。 包括细胞融合技术(即细胞杂交)、动植物细胞和组织培养技术、细胞器移植技术、染色体工程等。 单克隆抗体的制备原理和过程细胞杂交组织培养细胞器移植主要是指叶绿体和线粒体移植按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。是从染色体水平改变细胞遗传组成的细胞工程技术。目前主要应用于植物遗传育种领域。染色体工程 复制技术细胞核移植复制羊(四)基因工程 体外DNA重组技术：用人工方法把目的基因分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，然后把重组基因导入宿主细胞内，进行大量复制，并使遗传信息在新

7、的宿主细胞或个体中高效表达，最终获得大量目的基因的产物。产物如：蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。 主要用途：生产多肽、蛋白质类贵重药物；定向改造物种，创造优良新品种；基因疗法等。DNA重组技术（基因工程）：生产过程为天然基因合成的核苷酸序列内切酶连接酶载体重组的遗传物质转移到宿主细胞增殖、表达分离纯化目的产物获得目的基因组建重组质粒工程菌 生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点传统工艺生产 DNA重组技术生产 结构不明、组分变异、产品不纯 结构明确、组分单一、产品高纯 生物测定法检测活性 上市前的生物活性检测 常规质控 生物测定 常规质控 理化测定 生化药物

8、基因工程药物 我国生产的部分基因工程疫苗和药物 基因工程药物的生产许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。基因工程药物的种类胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使

9、其价格降低了30%-50%!干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产 基因诊断与基因治疗运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。（3）、基因工程与农牧业、食品工业运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还

10、可以培养出具有特殊用途的动、植物。生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆增加产奶量即将超量表达的牛生长激素基因转入牛体内培育转基因牛，从而提高产奶量。生产药物转有人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛，其牛奶中含有岩藻糖抗原。这种转基因牛奶可作为口服药，用来防治各种胃病改善牛奶的成分转入酪蛋白基因以增加牛奶中酪蛋白的产量等。转基因牛 在美国得克萨斯州，一种能发红色荧光的转基因斑马鱼在水中游动。一家美国公司打算将这种会发光的转基因热带鱼作为宠物在美国销售。转基因鸡主要可用以改进现有品种的遗传特性。例如增加

11、对病毒及球虫病的抗性，提高喂食效率，降低鸡蛋中的脂肪含量和胆固醇水平，提高鸡肉质量等等 。人们已经获得了转入禽类白血病病毒的外壳蛋白基因的转基因鸡，它对白血病病毒具有一定的抗性。转基因禽类对绵羊、山羊所进行的转基因研究大多集中于利用其乳腺作为生物反应器生产药用蛋白。 1991年，怀特等用将抗胰蛋白酶（ATT）基因转入绵羊，获得的4只转基因雌绵羊产生的乳汁中均含有ATT，可用于治疗遗传性ATT缺乏症及肺气肿。用同样的方法，人们已获得了可在乳汁中表达htPA（一种药用蛋白质）的山羊。 转基因绵羊、山羊3、基因工程与环境保护环境监测：基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染

12、。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。 环境污染治理：基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。生物技术衍生问题转基因生物的安全问题赞同的人：认为该项技术及其产品能大大提高人们的生活水平，怀疑的人：则认为它走得“太快”了，在现实生活中可能会产生副作用。 目前对转基因植物的安全性评价主要集中在两个方面

13、，一个是环境安全性，另一个是食品安全性。伦理问题隐私问题二、生物制品的种类1. 疫苗类药物(vaccines) 指用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成细菌类疫苗(bacterial vaccines)病毒类疫苗(viral vaccines)联合疫苗(combined vaccines)双价疫苗及多价疫苗(divalent vaccines and polyvalent vaccines)细菌类疫苗：有关细菌、螺旋体或其衍生物制成的疫苗类药物病毒类疫苗：病毒、衣原体、立克次体或其衍生物联合疫苗：指两种或两种以上疫苗原液按特定比例配合制成的具有多种免疫原性的灭活疫苗或

14、活疫苗。双价疫苗及多价疫苗：单一型抗原成分组成的疫苗单价疫苗；由两个或两个以上同一种但不同型抗原成分合并组成的含有双价或多价抗原成分的一种疫苗双价或多价疫苗2. 抗毒素及抗血清类药物（antitoxin and antisera) 人工被动免疫法，被动免疫制剂抗毒素凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的免疫血清抗菌或抗病毒血清用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清例：破伤风抗毒素、白喉抗毒素、抗蛇毒血清二、生物制品的种类3. 血液制品（blood products） 由健康人的血液或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分统

15、称为血液制品。例：人血白蛋白，人免疫球蛋白，人凝血因子，人纤维蛋白原二、生物制品的种类4. 重组DNA制品 binant DNA (rDNA) products 重组DNA制品是采用遗传修饰，将所需制品的编码DNA通过一种质粒或病毒载体，引入适宜的微生物或细胞系，DNA经过表达和翻译后成为蛋白质，再经提取和纯化而回收所需制品制得。二、生物制品的种类二、生物制品的种类重组DNA制品分类细胞因子类 例：重组人干扰素等生长因子类 例：重组人表皮生长因子等激素类 例：重组人生长激素酶类 例：重组链激酶疫苗 例：重组乙型肝炎疫苗单克隆抗体 例：注射用抗人T细胞CD3鼠单抗5. 诊断制品 diagonst

16、ic reagents 用于检测相应抗原、抗体机体免疫状态的制品，包括毒素、诊断血清、分群血清、因子血清、诊断菌液、抗原或抗体致敏血球、免疫扩散板等。体外诊断制品：特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂（盒）体内诊断制品：由变态反应或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂。二、生物制品的种类6. 其他制品 由有关生物材料或特定方法制成，不属于上述制品的其他生物制剂。如：胰岛素、胃蛋白酶、微生态制剂、核酸制剂二、生物制品的种类分子量不是定值：分子量大生化法结构难确证：化学结构和空间构象复杂 需检查生物活性：易受外界条件影响，生物检定法要求安全性检查：组分复杂，易引入污染物效价（含量）测定： 理化

17、法：有效成分的含量 效价测定和酶活力测定：有效成分的生物活性针对性强、毒副作用小、易为人体吸收，低免疫活性。三、生物制品的特点四、生物制品的全程质量控制生物制品多数为生物活性分子，性质不稳定，易被微生物污染，为了达到生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性的要求。进行原材料、生产过程和最终产品的全程质量控制。重点：鉴别有效成分确证 杂质均一性、纯度 安全有害物质、残余杂质 含量生物活性/比活性检查第二节 鉴别试验依据：生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点；方法：特异性反应、UV吸收系数、电泳迁移率、色谱保留时间、肽图；标准品特点：不是一项试验，而是依据其特异的分子结构和其他特性设计的一组试

18、验来全面评价。理化鉴别法：化学鉴别法（呈色和沉淀） 紫外分光光度法（单波长、双波长） HPLC法（与肽图合并）生化鉴别法：酶法、电泳法 生物鉴别法：血清学法 生物学法（如：家兔惊厥试验）鉴别方法一、理化鉴别法 1.化学鉴别法： 例：溶菌酶 - CONH- +Cu2+ 络合显色蛋白类生物制品颜色酸、碱、重金属、有机试剂沉淀胰蛋白酶紫色对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐糜蛋白酶紫色N-乙酰-L-酪氨酸乙酯例：胃蛋白酶沉淀鞣酸、重金属盐胰岛素溶解pH 2.5-3.0pH 5.1-5.3pH 2.5-3.5溶解pH 8.0-8.5微弱混浊 2.紫外分光光度法 用于芳香族氨基酸侧链，主要为酪氨酸、色氨酸、

19、苯丙氨酸。最大吸收波长、最小吸收波长，紫外图谱一致性 3. HPLC法： 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的主峰保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。 肽图与N-末端氨基酸序列分析合并蛋白类生物制品最精确的鉴别方法； 二、生化鉴别法（一）酶法酶是专一性强、催化效率高的生物催化剂。简便、快速、灵敏。(2) 注射用重组链激酶原液的检定琼脂糖煮沸溶胀+人凝血酶+人纤溶酶原链激酶(SK)原液生理盐水稀释待用+人纤维蛋白原SK与人纤溶酶原形成复合物, 从而激活后者成为人纤溶酶, 将人纤维蛋白原溶解+供试品溶解圈凝固（二）电泳法 目的：获得目的产品的一致性、同一性的电泳图谱和数据，常用于蛋白类生物制品。肝素鉴

20、别与国家肝素标准品对照，其移动位置相同 等电聚焦法：依据供试品的等电点进行区分。多条区带，批批相同SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：依据目的产品与对照品电泳迁移率的一致性。例如：重组人生长激素三、生物鉴别法（一）血清学法即：体外抗原抗体试验抗原+抗体凝集、沉淀、中和、补给免疫扩散、免疫电泳、荧光标记、酶标记破伤风抗毒素/人血白蛋白：破伤风毒素中和反应/免疫双扩散特异沉淀线破伤风抗毒素人血白蛋白抗人血清重组人白介素-2：免疫印迹法/免疫斑点法例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。 利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注10%葡萄糖注射液，惊厥停止。（二）生物学法利用生物体对

21、生物制品特定的生物活性的反应为基础进行供试品的鉴别第三节 杂质检查一般杂质检查： 氯化物、硫酸盐、铵盐、重金属、酸碱度、溶液的澄清度与颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣特殊杂质检查 生物污染物、产品相关杂质、工艺添加剂安全性检查 一、特殊杂质检查药品在生产和贮存过程中可能引入的特有杂质。分子结构特殊、生产工艺复杂、生物活性显著，因此特殊杂质检查尤其重要；意义：毒性、活性、变质。分类生物污染物：微生物污染，细胞成分如宿主细胞（菌）蛋白和外源性DNA；产品相关杂质：二聚体和多聚体，脱氨或氧化产物，突变物，裂解产物，二硫化物异构体；工艺添加剂：残余抗生素，蛋白分离剂，佐剂，产品稳定剂，防腐剂，细菌或病毒灭活剂。(一) 宿主细胞（菌）的残留蛋白目的：控制异源蛋白的含量以防超量后引起机体免疫反应方法：酶联免疫吸附剂法 ELISA如：大肠杆菌、假单胞菌、酵母工程菌(二) 外源性DNA残留量的检查宿主细