Bio-rad MicroPulser电穿孔仪中文说明书

1、MicroPulser电穿孔仪操作手册2018年 12月 27日1、 介绍（1）基本原理MicroPulser 电穿孔仪用于细菌、酵母和其他众多微生物的电击转化，转化时，高压电 脉冲作用于悬浮在小体积高阻介质中的样品。本系统由一个脉冲发生器（pulse generator） 模块、一个电击腔（shocking chamber）和一个装有电极的电击杯（cuvette）组成。样 本放置于电击杯的电极之间。MicroPulser模块包含一个电容器，将电容器充电至高电压, 然后模块将电容器中的电流放电到试管中的样品中。MicroPulser的电容放电电路产生具有指数衰减波形的电脉冲，如下图。当电容器放

2、电 至样品时，跨越电极的电压迅速上升至最大电压（or峰值电压，peak voltage；也称为初 始电压，Vo），并随时间（t）减小，如下式：vt = vo e Equation 1其中T =RC,为时间常数，是脉冲长度的简便表达式。R为电路电阻，单位为ohms （欧姆）。C为电容，单位为microfarad （微法拉）。根据方程1，t是电压下降至峰值电压1/e （37%）的时间。MicroPulser的内部电 路被设计以使E.coli、酿酒酵母及其他许多微生物可以得到最佳电穿孔，最佳转化效率发生在大约5ms的时间常数内。这些电穿孔条件是通过使用10微法拉电容器和将600欧姆电阻与样品池并联以

3、及将30欧姆电阻与样品池串联来实现的。Time (msec)阻与样品池并联以及将30欧姆电阻与样品池串联来实现的。Time (msec)Fig. 2. Exponential decay pulse from a capacitance discharge system. When the capacitor, charged to an initial voltage, is discharged into cells, the voltage applied to ttie cells decreases over time so that at time t = t, the volta

4、ge is (1/e) x VQ of the initial value.除时间常数外，电场强度是另一个决定转化效率的重要参数。电场强度E,是施加于电 极间的电压，公式为：E - V/d Equation 2其中，V为施加的电压，d为电极间的距离，单位为cm。电场强度和细胞的尺寸（size） 决定了横贯每个细胞的电压降，正是电压降可能是电穿孔中电压效应的重要表现。30 欧姆串联电阻的目的是在发生电弧的情况下保护设备电路。在正常操作条件下，当 样本在高电阻介质中，电阻不会影响施加在样本上的电压。但是，当样本的电阻较低时，电 阻将极大地降低施加在样品上的电压。施加在样品上的电压的分压降（frac

5、tio nal dr op） 由下式得到：R抑（RjO 1 Rsjmp J当Rsamp为600欧姆，对于样品就会有5%的电压降（30/（30+600） =0.048）。 基于这个原因，当样品溶液的电阻低于600欧姆时，不应进行电穿孔试验。这包括培养基 未彻底从细胞中去除的样本，残留有NaCI的DNA样本或连接混合物。MicroPulser能够 测量样本的电阻，若样本介质电阻过低则不会进行操作。(2)仪器参数操作(Manipulation of instrument parameters)Mic roPulser仪器的一些参数可以进行设置以达到最大转化效率，包括场强E,时间常 数T,截断指数衰减

6、脉冲的宽度。场强的设置可以有两种方式进行操作。一是，介于 200-3000V 电压可以直接在仪器上设置，这是最容易控制的。改变电压而保持其他条件不 变是大多数电穿孔优化程序的基础。第二，使用不同电极间隙宽度的电转杯也是改变场强的 一种方法。对于微生物的电穿孔，0.1和0.2cm间隙的电转杯最常被使用。E.coli的电穿 孔当使用0.1cm电转杯时通常使用1.8kV电压(E=18kV/cm)，而使用0.2cm电转杯 时使用2.5kV电压(E=12.5kV/cm)。这些电穿孔条件作为预设程序内置于MicroPulser 中，分别位于细菌设置菜单中的Ec1 (V=1.8kV)和Ec2 (V=2.5k

7、V)。另外，细菌设备 菜单中的第三个程序Ec3的电压为3.0kV (当电转杯为0.2cm时E=15kV/cm)，我们 发现可以得到比2.5kV更高的转化效率。时间常数可以通过改变样品的电阻而改变。样品电阻的改变可以通过两种方式。一是， 增加电穿孔介质的盐浓度或缓冲浓度会降低样品的电导，反之亦然，结果导致时间常数的改 变。第二，电转杯中样品体积与样品电阻呈反比，降低样品体积会增加样品电导。样品体积 对电导的影响在低电阻介质中是最显著的。这些影响因素将会在后面部分进一步介绍。Mic roPulser还包括一种在电压大于600V时比预期时间常数更快截断指数衰减脉冲的 方法。当脉冲被MicroPuls

8、er终止时，电压只在样品上作用指定长度的时间，可能在1.0 4.0 ms之间。下图显示了这种波形和真正的指数衰减脉冲的差异。Fig. 3. Truncatun of an exponential decay pulse by tfw MicroPuler. The sold lire shuvus Lhe voltFig. 3. Truncatun of an exponential decay pulse by tfw MicroPuler. The sold lire shuvus Lhe voltage applied t(j the cell as a hjnclion of time

9、 dunng 日 pule iBnninat&d alter 2.5 m$ec. The dashed line shows rho vdtago that would normEilly be applied 1u lhe celi& during 日 tru exponential decay pulso.Time (msec)2、 影响电穿孔的因素通过多年的研究，证实了微生物电穿孔的电条件( see Chang, et al., 1992, and Nickoloff, 1995, for overviews as well as for protocols on electropora

10、tion of nume rous species)。对大多数微生物而言，最佳电转化发生在与E.coli和酿酒酵母所 使用的电转化条件相似的条件下， E.coli 和酿酒酵母是当今研究中最常使用的两个物种。对 于E.coli的电穿孔,文献报道最常使用的条件是0.2cm电转杯,40川细胞样本，电压2.5kV, 时间5ms。对酿酒酵母，报告中最常使用的条件是0.2cm电转杯，40川细胞样品，1.5kV 电压和时间常数5ms。对许多细菌而言，如沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、幽门螺杆菌(Helicobacter)、包柔式螺旋体属(Borrelia)、链球 菌

11、属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和肠球菌属(Enterococcus),电 穿孔条件与 E.coli 一样。而对于其他的细菌，改变电场强度可以得到更高的电转化效率。 一个相似的案例可见于其他种属的酵母。Mic roPulser的设计可以精确施加E.coli和酿酒酵母获得最佳转化效率所需的脉冲参数。 当使用高阻样本时，时间常数被设置为5ms。对于这些微生物，MicroPulser预先设定了 在 0.1 或0.2 cm 的电击杯中电穿孔大肠杆菌，或在0.2 或0.4 cm 的电击杯中电穿孔酿 酒酵母时输送正确电压的程序。细胞生长(Cell Gr owth)对于大

12、多数细菌而言，在对数生长期的早期或中期收获细胞，可以得到最高的转化效率。 对于E.coli,当细胞进行稳定期，转化效率剧烈下降(Dower, 1990)。相反，大多数酵 母通常在对数生长的中期至晚期收获细胞。对于酿酒酵母(S.cerevisiae),对数生长晚期 的培养物相比早期的培养物，转化效率提高了 60倍(Becker and Guarente, 1991)。 获取细胞的最佳生长期通常随细胞种类而异。当制备一种新的物种的感受态细胞时，最好使 用为同种属而制定的程序。对所需考虑因素的建议和常用的制备感受态细胞的方法在 Dower et al(1992) 和 Trevors et al(19

13、92)的文章中被详细讨论。DNA大多数的电穿孔应用是将质粒DNA转入细胞中，需要提及的是，几乎任何形式的分子 都可以通过电穿孔被导入细胞中，包括DNA、蛋白、糖类、小分子等。除了少数例外，当 导入自主复制质粒时，使用超螺旋质粒进行电穿孔可以提高转化效率。但是，将整合入宿主 基因组的质粒当使用线性化质粒时，转化效率较高。例如，假丝酵母、毕赤酵母和四膜虫使 用线性质粒比超螺旋质粒效率更高。在E.coli和单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)电穿孔转化时， 使用松弛型环状质粒(relaxed circular plasmid)仅比使用超螺旋质粒的转化效率略低(Le

14、onardo and Sedivy， 1990， Park and Stewart， 1990)。但是，在 E.coli 和 Streptococcus pyogenes (酿脓链球菌)的电穿孔转化时，线性质粒比环状质粒的转化 效率低 103-104 倍(Shigekawa and Dowe r, 1988, Sim on and Ferr etti, 1991 )。在大多数物种中，每mol数量的质粒的电穿孔效率随着质粒大小的增加而降低，包括E. coli (Leonardo and Sedivy, 1990, Siguret et al., 1994)，Pseudomonas aerugin

15、osa (假单胞菌属)(De nnis and Sokol, 1995)，和 Str eptococcus the rmophilus (嗜 热链球菌属)(Somkuti and Ste in be rg 1988)。但是，有些物种，包 括Lactococcus lactis (乳球菌属)(Holo and Nes， 1995)， Enterococcus faecalis (肠球菌属) (Cruz-Rodz and Gilmore 1990)和 Clostridium perfringens(产气荚膜梭菌)(Allen and Blaschek，1990),转化效率似乎与质粒大小(即使高达2

16、0-30Kb)无关。尽管微生物的转化使用各种方法提取的质粒都可以完成，但质粒的纯度是影响转化效率 的一个因素。未纯化的小量制备的质粒DNA的转化效率明显低于经过各种方法纯化的质粒 DNA。利用Bio-Rad Quantum matrix制备的质粒与CsCl纯化质粒转化效率相当。通常，对于所有种类的微生物，转化频率随着 DNA 浓度的增加而增加。对于 E.coli， 转化频率(转化子/活细胞)受DNA浓度影响的范围在106 (10 pg/ml to 7.5 g/ml), 在这个范围内，DNA浓度决定了细胞被转化的概率。在较高的DNA浓度，高达80%的活 细胞可被转化(Dower et al，19

17、88)。因为获得的转化子的数量是转化频率和细胞数量 的产物，转化效率(转化子/ug DNA)在109-3x101。细胞/ml范围内随细胞浓度增加而 增加。因此，为了获得高的转化频率(transformation frequency)，请使用高的DNA 浓度。为了获得高的转化效率(transfor mation efficie ncy),请使用高的细胞浓度(和 低的DNA浓度以防止共转化cotransformation)。在每个实例中，小的样本体积(20-50卩1) 允许经济地使用 DNA 和细胞(see Dower et al., 1988, for a detailed discussion

18、 of these factors)。(3)电穿孔介质(Elect ropo ration Media)MicroPulser被设计以使用具有高阻介质的样本。基于此，当制备感受态细胞时，洗涤 以彻底去除培养基是非常重要的。若未彻底去除细胞中的培养基将导致电穿孔时在样本中产 生电弧。细胞应该用水或低离子强度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗涤至 少3 次。对许多微生物而言，甘油是一种方便的电穿孔介质，因甘油通常被用于细胞保存 的冷冻保存液。下图展示了几种不同生物学上的重要离子溶液对样品电阻的浓度效应。注意几点：体积对样品的电阻有重要影响一一对离子溶液，样品电阻和电转杯中样品的体积呈 反

19、比；含有二价离子的溶液的电阻比含有相同浓度单价离子的溶液电阻低；缓冲溶液的电阻受pH值影响。 即使极低浓度的离子化合物的加入都可以显著降低样品的电导，进而引发电弧作用。通 过乙醇沉淀法制备的DNA中残留的盐应该在用水或TE buffer溶解DNA前洗涤DNA以降低盐浓度。40003500 +30002500Cp n 40003500 +30002500Cp n (:*nt rstiQn (m M)Fig. 4. Resistance of solutions of (A) NaCI and MgCI2 and of (B) buff&rs af NaPQ4 at pH 6.1 and 7.3

20、and HEPES at pH 7.5. Resistance was measjretj in 0.2 cm cuvettes containing either 40 pl or 200 pl of solution at room temperature.表 1 表明，虽然将含有 10mM Tris， 1mM EDTA，pH8.0 溶液的质粒加入水中，确 实会降低样品的电导，但这应该不会导致不能使用Mic roPulser进行电穿孔试验。可以直 接使用酶反应的 DNA 进行转化，但进行高压脉冲操作时，最终电穿孔样品中的盐浓度应该 保持在低于5meq的水平。最后，连接混合物可能可以用于转化

21、，但DNA加入量必须极 低或者通过稀释(Wills on and Gough 1988)、透析(Hee ry and Dun ican 1989； Jacobs et al., 1990)或乙醇沉淀(Bottger, 198& Zabarovsky and Winberg 1990)降低离子强度。Table 1. Resistance of Water in 0.2 cm Cuvettes To Which TE Has Been Added1.tamphe(40 pl volume)sample(200 pl volume)6x 10s6x 10s35.0001120087004,8504,

22、700SAMPLEWaterWater + 1 pl TEWater + 5 p TEWater + 10$TE1 The resistance of 0.2 cm cuveues coniaining either 40 or 200 川 waler and the indicated volume of TE 00 inM Tris, pH 8U mM EDTA) was measured at 1000 V.3、 MicroPulser 操作说明参见图1 了解MicroPulser的各个组件，图5标注了各个按钮和LED的名称。.BIO HAD.MfcroPu/ser*Settings*F

23、unofHI MvnulMeafiurMientsAciuai*kVPulseRaise.BIO HAD.MfcroPu/ser*Settings*FunofHI MvnulMeafiurMientsAciuai*kVPulseRaiseandLowerButtonsDisplay LEDSettingsSettirbgs buttonLEDsMeasurementsbuttonPulsebuttonMeasurementsLEDsFig+ 乩 MicroPulser control panel,3.1 设置 MicroPulser 系统 将黑色电源线连接到 MicroPulser 脉冲发生器

24、模块的后面板。将电源线插入墙上 的插座或电源线。 拉下 MicroPulser 底部的折叠脚。将该脚插入电击腔底部的轨道中。将电击腔滑 块滑入电击腔。 将从电击腔引出的导线连接到 MicroPulser 前面板上的输出接口上；极性对电穿 孔过程并不重要。 打开电源开关。LED灯应亮起并且显示为“Ec1 ”，随后LED指示细菌设置状态 (Bacteria Setteing)。3.2 MicroPulser 的操作1)选择预设的程序MicroPulser 预设了数种常见的微生物的电击程序如下:ProgrpmCuvtt? Siz-?Pnet CqrMjrtkknSBacteriiaEc1Escbef

25、icZwa coftOJ cmLBQ1 pufeeEcfEschfict cofi12,50 kX 1 pUseSlA2 cm2.50kX 1 pUse* 2.5 ms陌AgDnodactienLm ibmgfeiQRen-s2.20 kV；l pUseEc3Eteroha cofi0.2 cm3.00 N 1 ixiseFungiSc2SaccAaranyces cerensiafl02 cm1,50 帼 1 pUtesSC4Saccftaro/nyces cereinsiae02 cm3,00 K i (AtseShSScnoosacchafomyces p(x?iie2 cm.00 Wr

26、 1 pUseDieOcfyaEfeSLun dZsracfeum0/ emi.DO k i pLtse. 1.0 m&Pc%1治朋s?o畔0-2 cm2-00 i pawUnless tl昭 ptise tnue 总 hunched below 5 ms, the unrt 新II deliver the optimal timconslant of -5 ms to 国mptes in hgh-600 W load:voltage and currentbmted at 100 A peak maximumOutput waveformDecaying or truncated-decay

27、ing exponewaveform wrth RC time consta ntOutput vottage andVoltage adjustable in 200-3,000 V rangepulse duration adjustmentwith 10 V precision; 5 ms defauft or1-4 ms with 0J ms precision; 5 bacterial and 5 fungal preset programsAmbient operating temperature35-35弋Dimensions (W x D x H)29x21 x 8 errWe

28、ht2,9 kg系统特点：处理样品的速度更快简单的一键“Pulse”操作、快速的充电时间。快速的程序选择内置的、优化的程序适合细菌和酵母的通用研究。电弧淬灭系统(ARQ, Arc quenching system)减少电弧效应，保护有价值样本的损失。更宽的参数手动优化空间一一手动程序允许在200-3000V范围内设置电压，精 度10v；脉冲时间可以在1.0-4.0ms范围内调整，精度0.1ms。3000V容量一一可以提高大体积的转化效率。紧凑型、节省空间的设计。可听见和可视化的脉冲指示。可显示时间常数和实际释放电压可监测重复性。为什么要用电转化？电转化是目前可用的效率最高的转化方法。它比化学转

29、化方法的转化效率高几个数量级 并且比其他方法重复性更好。MicroPulser被设计为E.coli、fungi和其他微生物的电转化 提供最佳的电条件，可以获得最高的转化效率。Example ResultsSpeciesStrainVolumeEfficiencyBacteriaE. cofiDH10B20 pl1,6 x 10E COfiDH10B20 pl3-2 x 10S aureusRN422O50 Ml1.2x 1CBA tumefaciensLBA44O420 Ml7.0 x 10fiE. cofiDH10B20 pl9,1 x 10uFungiS cerevisiaeSc94840 m8J x 104S cerevisiaeSC94830 pl22 k QS pombeCHP4O3200 pl1.4 x 10dD. discoideumKAx3800 pl88P pastonsX3340 pl1.6x 心Experiments were carried out in an ordinary laboratory and represent average efficiencies obtained using the preset programs. The efficiencies were measured per 1 pg plasmid b