医学免疫学课件：第22章 免疫学检测技术

1、第二十二章 免疫学检测技术 （Immunological detecting technology）一、原理 抗原、抗体间的特异性结合反应与定量指示和/或信号放大系统的有机结合，实现反应的可视性（定性）和可比对性（定量）。二、经典的免疫学检测方法 1. 免疫沉淀 2. 免疫扩散 3. 免疫凝集 4. 免疫标记 1. 沉淀反应 (precipitation reaction) 要形成免疫复合物的沉淀，抗原抗体必须交联起来。抗原抗体的比例不能过高或过低。抗原决定簇数目2。 1.2 免疫比浊反应 (immunonephelometry) 为最早应用与临床检测的抗原抗体沉淀反应，也是目前临床广泛应用的

2、自动检测方法。 2 免疫扩散反应(immunodiffusion) 依据物质在均质载体中从高浓度向低浓度扩散，并在扩散过程中逐渐形成浓度梯度这一性质。设计以凝胶为固相载体的抗原、抗体反应系统。2.1 单向免疫扩散（single radial immunodiffusion） 在含有抗体的琼脂糖凝胶上打孔，加入待测抗原，根据沉淀环的大小确定待测抗原含量 。2.2 双向免疫扩散 (double immunodiffusion ) 应用：（1）检测抗原或抗体量；（2）两种抗原是否有交叉反应 2.3 火箭电泳(Rocket electrophoresis) （pH值取抗体中性，抗原带负电荷） 2.4

3、免疫电泳(immunoelectrophoresis) 3. 凝集反应(agglutination) 抗原附着在大的载体颗粒表面时，加入特异性抗体会使载体颗粒发生肉眼可以观察到的凝集现象。 Coombs test hemagglutination 4. 利用标记物发展的抗原抗体探测 在肉眼不可见的抗原抗体反应体系中引进指示和/或放大系统，使信号变得可见，较弱的信号被增强。目前采用的方法是将特异性抗体与标记物结合，制备抗体标记物结合物。 常用的标记物主要包括荧光素、同位素、酶和化学发光物质。 4.1免疫荧光分析 细胞荧光染色（直接法，间接法）可以对细胞膜、细胞内和组织表达的特异性抗原进行检测。4

4、.2 放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA) 常用的同位素标记物为 125I ，131I，3H 。4.3 酶联免疫技术( enzyme linked immunosorbence assay，ELISA ) Direct ELISA ： 抗原包被到96孔板上 BSA封闭 加酶标 抗体 加入底物显色Indirect ELISA：抗原包被到96孔板上 BSA封闭 加未酶标第一抗体 加酶标第二抗体 加入底物显色Sandwich ELISA抗体包被到96孔板上 BSA封闭 加待测抗原样品 酶标抗体 加入底物显色建立sandwich ELISA方法的基本条件： 1. 被检测抗原具有多

5、价（决定簇） 2. 二个抗体分别针对不同决定簇。Elispot 酶免疫斑点试验T cellCD3IFN 蛋白印迹法（Western blotting）结合了SDS电泳和ELISA二种方法的共同优点。 蛋白质芯片技术 免疫磁珠 流式细胞技术(flow cytometry )免疫组织化学技术 三、免疫活性细胞功能、数量测定 1. 淋巴细胞转化实验 原理：淋巴细胞在有丝分裂原的作用下，能够发生增殖、分化，通过指示系统观察细胞增殖过程中细胞合成代谢物质量的变化，即可得知该细胞功能的变化。 有丝分裂原的作用有细胞类型的差异，也有动物种系差异。常见有丝分裂原对人和小鼠T、B细胞作用 小鼠 人 T B T B刀豆素A(ConA) 植物血凝素（PHA) 美洲商陆（PWM) 脂多糖（LPS) 葡萄球菌A蛋白（SAC) 纯蛋白衍化物（PPD) 葡聚糖 抗Ig抗体 2. 细胞表面分子标记 原理：不同类型的免疫活性细胞在免疫应答的不同阶段表达不同的细胞表面分子，通过检测特定标记分子数量的变化，即可得知该细胞数量或功能变化。 流式细胞检测技术、免疫荧光检测技术、免疫组织化学检测技术、免疫化学发光技术常被用于上述目的。 3. 细胞因子检测 （1）细胞生物学活性测定方法 原理：不同类型的免疫活性细胞在免疫应答的不同阶段，接受不同细胞因子的调控，通过检测特定时段、特定