发酵工程：青霉素的生产工艺

1、青霉素的生产工艺青霉素的定义 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素的结构示意图 青霉素的结构式常见的青霉素产品 青霉素类抗生素的毒性很小，由于-内酰胺类作用于 细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反响外，在一般用量下，其毒性不甚明显，是化疗指数最大的抗生素。青霉素针剂和口服青霉素能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。 青霉属于曲霉科

2、(Eurotiaceae)。青霉与人类生活息息相关，少数种类能引起人和动物的疾病，许多种青霉能造成柑桔、苹果、梨等水果的腐烂；对工业产品、食品、衣物也造成危害；在生物实验室中，它也是一种常见的污染菌。加强通风、降低温度、减少空气相对湿度，可以大大减轻青霉的危害。 在另一方面，青霉对人类非常重要：在工业上，它可用于生产柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸等有机酸和酶制剂；非常名贵的娄克馥干酪、丹麦青干酪都是用青霉酿制而成的；最著名的抗生素青霉素就是从青霉的某些品系中提取而来，它是最早发现、最先提纯、临床上应用最早的抗生素；近期发现的另一重要抗生素灰黄霉素，是由灰黄青霉产生的，是抑制诸如脚癣之类的真菌性皮肤

3、病的最好抗生素。青霉素生产的工艺过程某公司的仿真系统，模拟整个流程一、青霉素的发酵工艺过程1、工艺流程1丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管25C，孢子培养，7d斜面母瓶25C，孢子培养，7d大米孢子26C，种子培养56h一级种子培养液27C，种子培养，24h二级种子培养液2726C,发酵,7d发酵液。2球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管25C，孢子培养，68d亲米25C，孢子培养，810d生产米28C，孢子培养，5660h种子培养液2625-24C，发酵，7d发酵液。二、影响发酵产率的因素 1基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或抑制或对菌丝生长产生抑制如葡萄糖的

4、阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了防止这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或抑制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 CO2 释放率予以调节。 2温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差异 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低

5、发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 3 pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量防止 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度上下的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率缺乏以中

6、和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。 4溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 那么造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。几种常见便携式溶氧检测仪 5菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在

7、某一溶氧水平上到达平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。青霉菌的菌丝形态 6菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1h时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 0. 015h-1h时, 比生产速率与比生长速率无关。因此，要在发酵过程中

8、到达并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 h。这一比生长速率称为临界比生长速率。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能到达很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有局部菌丝自溶, 抵消了一局部生长, 故虽然表观比生长速率低, 但实际比生长速率却要高一些。 7菌丝形态 在长期的菌株改进中 , 青霉素产生菌在漂浮培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者那么由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而

9、允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并防止结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。三、 主要工艺控制要点1种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C 培养 7 天, 真空枯燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、

10、尿素为主的种子罐内，26 C 培养 56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按 10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27C 培养 24h, 菌丝体积 10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。某生产车间 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有0. 5% -1. 0 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移入罗氏瓶培养生产大米孢子(又称生产米), 亲米和生产米均为25 C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到 3-4 天, 大米外表长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米外表能均匀生长, 待10 天左右形成绿色

11、孢子即可收获。亲米成熟接入生产米后也要经过剧烈振荡才可放置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 C冰箱内. 工艺要求将新鲜的生产米 (指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接入含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28 C 培养 50-60h当pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在 100- 130m, 每毫升的球数为 6万 -8万只, 沉降率在 85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml 范围的要求, 计算移种体积, 然后接入发酵罐, 多余的种子液弃去。球状菌

12、以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空枯燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。2培养基成分的控制 a. 碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 进行流加。 b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源硫酸氨、氨水或尿素。 c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次参加量不大于0.1%, 并采用屡次参加, 以防止前体对青霉素的毒害。 d.无机盐 参加的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作

13、用, 必须严格控制铁离子的浓度, 一般控制在30 g/ml 。3发酵培养的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。c. pH 值控制 对pH 值的要求视不同菌种而异, 一般为 pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。d. 温度控制 前期 25- 26C,

14、 后期 23C, 以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e. 溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30% 。通风比一般为1 : 0. 8L/(L min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f. 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌来消泡, 应当控制其用量并要少量屡次参加, 尤其在发酵前期不宜多用, 否那么会影响菌体的呼吸代谢。g. 发酵液质量控制 生产上按规定时间从发酵罐中取样 , 用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称 镜检 ,根据 镜检 中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各