微生物学检验实验：支原体、衣原体的检测

1、实验内容：支原体、衣原体的检测没有细胞壁的原核细胞型微生物呈高度多形性细胞膜含固醇能通过0.45m滤菌器二分裂繁殖，含DNA与RNA能在无生命培养基中繁殖的最小微生物 支原体 (Mycoplasma)营养要求较高，培养需加入10%-20%的血清在pH7.88.0间生长，低于7.0则死亡（解脲脲原体pH6.06.5）生长缓慢典型的菌落呈荷包蛋样液体培养基不易见到混浊是引起细胞培养污染的一个重要因素Mycoplasma infection in cell culture 无细胞壁高度多形性对作用于细胞壁上的药物均耐药可通过滤菌器培养条件相似（高渗）支原体与细菌L型的共性细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理

2、化或生物因素的直接破坏或合成被抑制，这种细胞壁受损的细菌一般在普通环境中不能耐受菌体内的高渗透压而胀裂死亡。这种细胞壁受损的细菌能够生长和分裂者称为细菌细胞壁缺陷型或细菌L型（L form） 支原体与细菌L型的区别 支原体 L型 在遗传上与细菌无关 与原菌相关，常可以回复 细胞膜含高浓度固醇 细胞膜不含固醇 生长慢，菌落小， 菌落稍大， 液体培养混浊度极低 液体培养有一定混浊度主要致病性支原体（一）肺炎支原体原发性非典型肺炎primary atypical pneumonia（间质性肺炎）占非细菌性肺炎的三分之一以上飞沫传播，夏末秋初为好发季节症状较轻，发热、咳嗽、与感冒症状相似，有时有呼吸道

3、外并发症（二）泌尿生殖道感染支原体解脲脲原体、人型支原体传播途径：性传播、垂直传播非淋菌性尿道炎自然流产、出生缺陷、死胎、不孕（育）（三）穿透支原体穿透支原体是1990年首次从1例HIV阳性艾滋病患者尿中分离出的一种新支原体 穿透支原体感染 是艾滋病的辅助致病因素 严格细胞内寄生 有独特发育周期 能通过滤菌器 原核细胞型微生物 衣原体 Chlamydia革兰阴性，圆形或椭圆形体；具有细胞壁，其组成与革兰阴性菌相似；有独特的发育周期，行二分裂方式繁殖；有核糖体和较复杂的酶类，但缺乏供代谢所需的能量来源，营专性细胞内寄生 对多种抗生素敏感 独特的发育周期 原体（elementary body，EB

4、） 始体（initial body）生物学性状原体（elementary body, EB）始体（initial body）网状体（reticulate body, RB） 小 大有致密的类核结构，有胞壁，发育成熟体大，电子致密度较低，无胞壁Giemsa 紫色，Macchiavello 红色Macchiavello 蓝色高度感染性（有毒性）无感染性（无毒性）无繁殖能力代谢活泼，以二分裂方式繁殖胞外稳定性强胞外稳定性弱 包涵体含糖原，被碘液染为棕褐色实验内容支原体培养、鉴定药敏沙眼衣原体抗原检测（胶体金法）支原体培养、鉴定药敏本试剂盒适用于解脲支原体（Uu）、人型支原体（Mh）原理： 当Uu和M

5、h生长时，尿素和精氨酸分解生成的碱性物质引起pH上値上升，培养基由黄色变成红色。培养基内加抑菌剂，可抑制生殖道中的细菌和真菌的生长。培养基：支原体基础肉汤、马血清、混合抗生素、生长因子、尿素、精氨酸、酚红指示剂等。标本采集男性：用无菌棉拭子插入尿道约2cm处旋转，静止数秒钟后取材。女性：支原体标本抹去宫颈口粘液，用无菌拭子插入宫颈管l2cm旋转取材。尚可用前列腺液、精液、尿液离心沉淀物作标本。支原体对细胞表面有很强的亲和力，应尽可能多采集细胞。检测方法取所需数量试剂复温至室温，编号后，将没接种标本前培养基取100ul加入A1孔，设为阴性对照接种标本：棉拭子插入培养液中充分振洗并在瓶壁挤干拭子；

6、液态标本取150-200ul于培养基中摇匀。将混有标本的培养基100ul加入除A1外的各微孔中。加矿物油1滴覆盖。置培养药敏板于37培养，24h和48h分别观察记录结果。按结果填写报告单。结果解释1、阴阳性结果判定标准：黄色或橙黄色阴性（-）；清晰透明红色阳性（+）；浑浊红色：污染。2、A1孔（阴性对照孔）应为阴性，若为阳性表示有污染，本次试验无效。3、A2孔（+）：仅A2孔变红，表示有支原体生长，半定量计数104ccu，如果每份标本浓度 104ccu，B排第1、2孔（B1，B2)微管就会发生颜色变化。Uu：在24h记录结果Mh：在48h后记录结果4、B1孔（+）：解脲支原体阳性，Uu 104

7、ccu； B2孔（+）：人型支原体阳性，Mh 104ccu5、药敏试验结果的判断 药敏孔变红，表示孔中有Uu或者Mh生长，显示支原体对该种抗生素耐药或中度敏感，反之则敏感。A3-A14，B3-B14 相成对表示药物的高低浓度。H（即A排）：高浓度药敏孔L（即B排）：低浓度药敏孔An（-）Bn（-）：敏感An（-）Bn（+）：中敏An（+）Bn（+）：耐药ECC 环酯红霉素DOX 强力霉素JOS 交沙霉素THI 甲砜霉素CLA 克拉霉素ERY 红霉素CPF 环丙沙星ROX 罗红霉素CRA 可乐必妥MIN 美满霉素AZI 阿奇霉素GAT 加替沙星注意事项培养基接种到药敏板前要充分混匀培养基变红，但

8、浑浊，不能报阳性，或重做实验因为大部分标本是不可溶性物质，可能导致药敏板上微孔接种量不均一，导致药敏结果不合理，此时，请弃用此种药物。沙眼衣原体抗原检测（胶体金法）原理： 用抗衣原体脂多糖单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于固相硝酸纤维素膜，并和胶体金标记的另一抗衣原体脂多糖单克隆抗体及其他试剂和原料制成，应用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心的形式建立的衣原体检测方法。操作步骤将样品处理管放在工作台上，加入6滴溶液A将采样拭子放入含有溶液A的样品处理管中，室温放置，在处理过程中不断旋转并在管壁挤压拭子，使液体不断被挤出，重复多次，处理2分钟。加入6滴溶液B，旋转并挤压拭子，充分混匀后滴2-3滴在检测试剂盒的加样孔中，然后等待结果10min内完成结果的判读试剂组成沙眼衣原体抗原快速检测试剂卡： 包被有抗衣原体脂多糖单克隆抗体-I、抗衣原体脂多糖单克隆抗体-II和羊抗鼠IgG试纸条溶液A：NaOH溶液溶液B：HCl溶液样品处理管参考范围本产品对E型沙眼衣原体最低检出量为4*103IFU/ml，检测结果 4*103IFU/ml为阳性， 4*103IFU/ml为阴性【检验结果的解释】阴