藤酮对体外培养星型胶质细胞毒性作用

1、藤酮对体外造就星型胶质细胞毒性作用刘辉，张筱军，吴强，董兆君【关键词】鱼藤酮；星型胶质细胞；活力；增殖摘要：目的不雅察鱼藤酮对体外造就星型胶质细胞毒性作用的特点。要领体外造就大鼠中脑星型胶质细胞，接纳胶质纤维酸性卵白(GFAP)免疫荧光法断定。不雅察染毒星型胶质细胞形态，检测细胞活力，通过生长曲线阐发鱼藤酮对星型胶质细胞增殖的影响以及RTPR检测破绽毗连卵白(nnexin43,X43)RNA表达。效果05l/L鱼藤酮染毒24h即可引起显着的细胞形态改变；075，10，20l/L鱼藤酮染毒时星型胶质细胞活力显着低落，乳酸脱氢酶开释量明显增长；05l/L以上鱼藤酮可显着按捺胶质细胞增殖，X43RN

2、A表达低落。结论鱼藤酮对体外造就星型胶质细胞可以产生显着的毒性损伤作用，但与神经元比力，星型胶质细胞对雷同剂量的鱼藤酮染毒具有更强的耐受本领。关键词：鱼藤酮；星型胶质细胞；活力；增殖TxieffetsfrtennenpriaryulturedastrgliainvitrAbstrat：bjetiveTstudythetxieffetsinduedbyrtennenpriaryulturedastrglia.ethdsRatastrgliaereulturedandidentifiedbyglialfibrillaryaidprtEin(GFAP).TTassayandrphlgialbserv

3、atinereusedtevaluatethetxiityfrtennenastrglia,ellprliferatinandtheexpressinfX43RNAeredetetedbygrthurveanalysisandRTPR.Resultsellrphlgyashangedafterbeingexpsedt05l/Lrtennefr24hurs;theviabilityfellulturesassignifiantlydereasedafterbeingtreatedith075,10and20l/Lrtenne;ellprliferatinasinhibitedandtheexpr

4、essinfX43RNAassuppressedbviuslyby05and10l/Lrtenne.nlusinDsedependenttxieffetsnpriaryulturedastrgliauldbeinduedbybeingexpsedtrtenne,butastrgliahavehighertleranetthesaedsefrtenneparedithneurns.Keyrds：rtenne;astrglia;viability;prliferatin鱼藤酮(Rtenne)是典范的线粒体按捺类农药，普及应用于农业消费中。研究证明，恒久打仗该类化合物可导致中枢多巴胺神经元损伤，动物

5、产生雷同帕金森病的病症，但其详细作用机制尚不完全明晰1，2。星型胶质细胞(Astrglia)是中枢神经体系数目最多、漫衍最广的胶质细胞，在神经体系发育、突触通报、神经构造修复与再生、神经免疫以及多种神经疾病的的病理机制等方面都起着非常紧张的作用。在病理条件下，成效改变的星型胶质细胞大概是帕金森病等神经退行性疾病产生、生长的始动因素或促进因素3。本研究以原代造就星型胶质细胞为试验工具，不雅察体外鱼藤酮染毒对星型胶质细的毒性效应特点，以期为探究神经退行性疾病的发病机制提供根据。1质料与要领11重要试剂和仪器鱼藤酮(美国Siga公司)；胎牛血清造就基(DE/F12)(美国Gib公司)；类尺度胎牛血清

6、(兰州民海生物公司)；Tripure(美国Rhe公司)；乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(TT)(美国Aers公司)。酶标仪(美国BIRAD公司)；PR仪(德国Eppendrf公司)；荧光显微镜E600(日本尼康公司)。12星型胶质细胞原代造就、纯化和断定生后3dSD新生大鼠(第三军医大学大坪病院动物所)；断头取中脑构造，根据文献4要领分散和纯化星型胶质细胞，经3次传代后即可得纯化的星型胶质细胞。星型胶质细胞断定接纳免疫荧光法检测胶质纤维酸性卵白(GFAP)表达。一抗为兔抗鼠GFAP(1100)抗体，二抗为异硫氰酸荧光素(FIT)标识表记标帜的羊抗兔IgG(150)，荧火

7、显微镜下，以490n波长的引发光不雅察，GFAP阳性细胞即为星型胶质细胞。13染毒星型胶质细胞形态不雅察将制备的细胞悬液接种于24孔造就板中，用含有20%胎牛血清的造就液造就5d，待细胞根本长满孔壁后，换成含00，01，05和10l/L鱼藤酮的造就液。各设2个平行孔，造就24h后，不雅察鱼藤酮对星型胶质细胞的影响，摄像记载。14TT法检测星型胶质细胞活力将制备的细胞悬液接种于96孔造就板中，接种密度为50104/l。待细胞根本长满孔壁后，换成含00，01，025，05，075，10和20l/L鱼藤酮的造就液200l。每组设6个平行孔，造就24h后每孔参加20lTT继承造就4h，然后各孔参加15

8、0l二甲基亚砜溶解紫色结晶，于酶标仪上测定波长490n的吸光度(A)值，吸光度值的巨细反响胶质细胞成活数目及活性。15乳酸脱氢酶(LDH)开释量测定鱼藤酮染毒浓度别离为00，01，025，05，075，10和20l/L，星型胶质细胞LDH开释量测定按试剂盒说明书操纵。16生长曲线阐发鱼藤酮对细胞增殖的影响细胞接种于24孔板中，别离参加含00，01，05和10l/L鱼藤酮的造就液1l，接种密度为50104/l，每组设4个平行孔。起始日为当天接种细胞，越日起，即开始检测每孔中的细胞总数，用计数板计数，一连不雅察5d，取4个孔的均匀值绘制生长曲线。17RTPR检测破绽毗连卵白X43RNA表达PR引物

9、参照文献5方案，由上海英骏生物技能公司合成，设磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)阳性产物作为PR内参照。X43和GAPDH扩增片断长度别离为291和542bp，引物序列如下：X43：5TAAGAATGGA3；5ATTTGGTTGTGTGGGGAA3，GAPDH：5GATGATGATATAT3；5TGTATATTGTTGT3。逆转录反响体系包罗4gRNA、lig(dT)15、RNA酶按捺剂、dNTPs、5RT缓冲液和鼠原白血病逆转录酶(LV)，反响体积为20l。接纳X43和GAPDH同管扩增的要领，PR循环参数为：95预变性5in后进入循环，95变性30s，60复性30s，72延伸45s，循环30次，末了72分外延伸10in。每一个样品接纳3管平行扩增，而且重复1次。18统计阐发接纳SPSS100软件举行方差阐发和t查验。2效果21鱼藤酮对星型胶质细胞形态的影响(图13)正常星型胶质细胞为扁平梭形或星形，有细长突起，胞浆富厚，胞核较大，地步明晰，有12个核仁，位于核中心；免疫荧光法染色表现造就的星型胶质细胞阳性率达95%以上。01l/L鱼藤酮染毒细胞形态未见显着改变；05l/L鱼藤酮染毒24h可引起显着的细胞形态变革，细胞胞体折光加强，细胞间隙增大，有少量细胞圆缩肿胀或脱壁；随着染毒剂量的增大，损伤程度显着加重，胞浆内出现中毒颗粒，细胞数目显着淘汰。图1正