酶工程微生物发酵产酶 (2)PPT

1、关于酶工程微生物发酵产酶 (2)第一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶概述酶的发酵生产经预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，获得人们所需的酶的过程前提 选育到性能优良的产酶微生物生产方式固体培养 霉菌液体深层发酵 现代发酵工业的主要方式固定化培养 固定化细胞、固定化原生质体第二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶本章主要内容微生物细胞中酶生物合成的调节产酶微生物的特点以及酶发酵生产常用的微生物发酵工艺条件及控制酶发酵动力学概述固定化细胞发酵产酶固定化原生质体发酵产酶第三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生

2、 物 发 酵 产 酶酶生物合成的基本理论酶是蛋白质 如何获得蛋白？ 蛋白生物合成从基因到蛋白质：遗传信息的传递 中心法则要生物合成一个酶，首先应知道这个酶对应的基因生成的多肽链必须经过正确的加工修饰，并正确折叠，才能生成有活性的酶转录和翻译中的生物调节作用第四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的过程RNA的合成 转录以DNA为模板，以核苷三磷酸（dNTP）为底物，在RNA聚合酶作用下，生成RNA的过程起始 延伸 终止转录后修饰：切除非编码区，碱基修饰，获得成熟的mRNA第五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成

3、的过程肽链的合成 翻译以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子，合成多肽链的过程氨基酸活化生成氨酰-tRNA肽链合成起始第六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的过程肽链的合成 翻译肽链延伸肽链合成的终止肽链翻译后加工Met/fMet切除SS肽链折叠第七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节组成型酶（constitutive enzyme）在细胞中的量比较恒定，环境因素对这类酶的合成速率影响不大适应型酶（adaptive enzyme）在细胞中含量变化很大，其合成速率受环境

4、因素影响显著在所有的生物中，转录水平的调节控制（基因的调节控制）对酶的生物合成至关重要原核生物中酶生物合成的调节主要发生在转录水平第八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节 转录水平操纵子学说（operon theory）与生物合成相关的四个基因调节基因 (regulator gene)启动基因 (promoter gene)操纵基因 (operator gene)结构基因 (structural gene)调节的主要原理调节基因 阻遏蛋白 结合效应物 结构变化 亲和力变化阻遏蛋白与操纵基因结合，产生空间排斥作用，妨碍RNA聚合酶与启动基因结合，阻

5、碍RNA的转录效应物结合阻遏蛋白之后，阻遏蛋白结构改变，不能结合操纵基因，RNA聚合酶可以结合启动位点，进行转录第九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节 转录水平操纵子学说启动基因的两个位点(1) RNA聚合酶结合位点(2) cAMP-CAP复合物结合位点 只有 cAMP-CAP 复合物到达启动基因位点时， RNA 聚合酶才能顺利结合到相应位点，开始转录。第十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节 转录水平操纵子学说（operon theory）操纵子 结构基因 + 操纵基因 + 启动基因诱导型操纵子

6、（inducible operon）诱导物激发基因大量表达乳糖操纵子（Lac operon）阻遏型操纵子（repressible operon）阻遏物妨碍基因的正常表达色氨酸操纵子（Trp operon）第十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节 转录水平调节模式 1：分解代谢物阻遏作用某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏了某些诱导酶生物合成的现象连锁效应实质 cAMP 通过启动基因调控酶的合成解决 添加 cAMP，控制易用碳源的用量第十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节 转录水

7、平调节模式 2：诱导作用加入某些物质（诱导物）使酶的生物合成开始或加速进行的现象诱导物（inducer）酶催化作用的底物或其底物类似物第十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的调节 转录水平调节模式 3：反馈阻遏作用即产物阻遏，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象阻遏物（repressor）一般是酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物阻遏物 + 阻遏蛋白 O基因第十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式（重点）微生物细胞生长曲线（四阶段）延迟期（调整期）生长期（对数生长期

8、）平衡期衰退期酶的生物合成模式（四类） 根据酶产生与细胞生长的关系同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型第十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式酶生物合成的四种模式时间细胞/酶浓度同步合成型时间细胞/酶浓度延续合成型时间细胞/酶浓度中期合成型时间细胞/酶浓度滞后合成型细胞浓度酶浓度第十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行（生长偶联 型）大部分组成酶属于此类此类酶的合成可由其诱导物诱导生成，不受分解代谢物阻遏和反馈阻遏作用酶对应的 mRNA 很不稳定典型例

9、子：米曲霉培养生产单宁酶 EC 3.1.1.20（书p36 图2-8）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度第十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式延续合成型酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期 后，酶还能延续合成 一段时间此类酶的合成可被诱导物所诱导，一般不受分解代谢物阻遏此类酶所对应的 mRNA 稳定性好举例：黑曲霉培养生产聚半乳糖醛酸酶 3.2.1.15（书p37 图2-9）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度第十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始

10、，当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随之停止酶的合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用酶所对应的 mRNA 稳定性较差举例：枯草杆菌碱性磷酸酶 EC 3.1.3.1 受其水解产物磷酸的反馈阻遏作用（书p38 图2-10）时间细胞/酶浓度细胞浓度酶浓度第十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式滞后合成型当细胞生长一段时间或进入平衡期 后，才开始合成并大量积累酶许多水解酶属于此类阻遏物 的存在延缓了酶的合成此类酶的 mRNA 稳定性好滞后合成型 延续合成型举例：黑曲霉酸性蛋白酶 EC 3.4.23.6 （书p38 图2-11）时间细胞/酶浓度细

11、胞浓度酶浓度第二十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶生物合成的模式Summary关键因素酶对应的 mRNA 稳定性培养基中是否存在阻遏物延续合成型 是最理想的合成模式通过基因工程、代谢工程、细胞工程等手段，筛选优良菌株，使合成模式接近延续合成型细胞浓度酶浓度第二十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶产酶微生物的特点酶的产量高通过筛选获得高产菌株，妥善保存并定期复壮容易培养和管理对培养基成分和工艺条件没有苛刻的要求，适应能力强产酶稳定性好能稳定生长并表达所需的酶，菌种不易退化有利于酶的分离纯化酶的分离提纯要比较容易，能获得较高

12、纯度安全可靠菌种对环境及对操作人员安全，不产生不良影响第二十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶产酶微生物的特点产酶微生物的分离和筛选 样品的采集：从富含该酶作用底物的场所采集样品富集培养：投其所好，取其所抗 菌种纯化与分离：微生物的纯培养（pure culture）初筛：选出产酶菌种，以多为主复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主第二十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶产酶微生物的特点例：-淀粉酶生产菌的筛选 产-淀粉酶的微生物可以淀粉为碳源加以利用，在含KI-I2 的淀粉培养基上，菌落周围因分泌出的-淀粉酶将淀粉水解

13、而导致蓝色消失，生成“水解圈”。第二十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶产酶微生物的特点例：蛋白酶生产菌的筛选 在培养基中添加酪蛋白，经蛋白酶的水解，培养基相应位置变为澄清的“水解圈”。第二十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶产酶微生物的特点酶在微生物细胞中的存在形式胞外酶微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等）胞内酶指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控组成型酶一般是胞内酶第二十

14、六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物细菌大肠杆菌（Escherichia coli）枯草杆菌（Bacillus subtilis） 应用最广泛的产酶微生物放线菌链霉菌（Streptomyces）霉菌 使用种类最多的产酶微生物曲霉属、青霉、根霉等酵母啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）假丝酵母属（Candida）第二十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 细菌大肠杆菌（E. coli）一般产胞内酶主要的酶品种谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等基因工程操作酶

15、：限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等枯草杆菌（B. subtilis）能产生多种胞外酶主要的酶品种淀粉酶类：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶类：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶类：碱性磷酸酶（细胞间质）、5-核苷酸酶等第二十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 细菌枯草杆菌产果胶酶第二十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 放线菌链霉菌（Streptomyces）生产葡萄糖异构酶的主要微生物主要酶品种青霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶、碱性/中性蛋白酶等含有丰富的16-羟化酶，用于甾体药物转

16、化第三十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 放线菌链霉菌产聚乙烯醇降解酶第三十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌黑曲霉（Aspergillus niger）可生产多种酶（胞内酶或胞外酶）主要酶品种糖化酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶等米曲霉（Aspergillus oryzae）米曲霉中糖化酶和蛋白酶活力较强，因此广泛应用于酿造行业和食品行业米曲霉为一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等主要酶品种糖化酶、果胶酶、氨基酰化酶、磷酸二

17、酯酶、核酸酶等第三十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌黑曲霉（A. niger）米曲霉（A. oryzae）第三十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌红曲霉属（Monascus）菌落成熟后产红色色素，颜色较深腐生真菌，能耐受 pH 3.5 和 10% 酒精，尤嗜乳酸红曲霉中含有丰富的酶系，并且自身能合成生长素，无须外源供给，尤其是葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶，在食品行业使用广泛主要酶品种-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、酯酶等第三十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微

18、生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌青霉属（Penicillium）属半知菌纲，也有的列入子囊菌纲腐生真菌，存在于空气中及腐烂的物质表面常用的工业发酵微生物，广泛用于有机酸、干酪和抗生素的生产主要菌种和酶的种类产黄青霉（Penicillium chrysogenum）葡萄糖氧化酶、纤维素酶、果胶酶、青霉素酰化酶等橘青霉（Penicillium citrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5-磷酸二酯酶、核酸酶等第三十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌青霉属（Penicillium）第三十六张，PPT共九十八页，创作于20

19、22年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌青霉产聚乙烯醇降解酶第三十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌木霉（Trichoderma）属于半知菌亚门，丛梗孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等木霉具有较强分解纤维素能力，绿色木霉（T. viride）通常能够分泌高活性纤维素酶，对纤维素的分解能力很强，因此在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展最后整个菌落全部变成绿色产 纤维素酶 的重要菌株；亦用于生产 17-羟化酶，可用于甾体药物转化第三十八张，PPT共

20、九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌木霉（Trichoderma）木霉适应性很强，菌落扩展很快，特别在高温高湿度条件下几天内木霉菌落可遍布整个料面绿色木霉 (T. viride) 的菌落哈茨木霉 (T. harzianum) 的显微形态第三十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌根霉（Rhizopus）具有 11-羟化酶，是用于甾体药物转化的重要菌株产酶品种糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等毛霉（Mucor）毛霉能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋

21、白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等产酶品种蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等第四十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 霉菌根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）第四十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 酵母啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）广泛应用于食品工业细胞呈圆形、卵形、椭圆形，在麦芽汁培养基上菌落白色有光泽产酶品种醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、转化酶等第四十二张，PPT共九十八页，创作于2022年

22、6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物 酵母假丝酵母属（Candida）细胞呈圆形、卵形或长形，出芽成假菌丝不产色素，在麦芽汁琼脂培养基上菌落乳白色或奶油色产酶品种脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶等产17-羟化酶，用于甾体药物转化具烷类代谢的酶系，可利用石油及其加工废料为碳源第四十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵生产常用的微生物菌种的选择了解产某种酶的菌种有哪些对这些菌种的性质进行全面的考察产酶机理代谢途径营养组成生长和繁殖情况考察菌种产酶的能力及稳定性考虑是否对菌种进行改良优化培养条件第四十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月

23、微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制发酵工程（fermentation engineering）采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面囊括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程工业发酵过程厌氧发酵生产过程，如酒精，乳酸的生产通气（有氧）发酵生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等第四十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制发酵工程的产品

24、第四十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制发酵生产：从实验室到工业生产菌种筛选平板培养摇瓶试验发酵罐中试工业发酵生产上游下游第四十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制第四十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制发酵基本流程和步骤培养基（种子培养基、发酵培养基）的配制培养基、发酵罐及辅助设备的消毒灭菌将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物产物抽提、精制，以得到合格的产品回收

25、或处理发酵过程中产生的废弃物和废水第四十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制发酵工艺条件控制的主要内容细胞活化与扩大培养培养基的成分及其配制pH 值调节温度的调节控制溶解氧的调节控制提高酶产量的措施第五十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制细胞活化与扩大培养菌种保藏短期保藏长期保藏菌种活化使用前接种于新鲜培养基上，培养，以恢复细胞生命活动能力扩大培养为保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化细胞要经一级至数级扩大培养一般培养到细胞处于对数生长期为宜采用孢子接种，则应培养至孢子成熟期各有哪些方法

26、？第五十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制培养基的成分及其配制培养基的组成碳源、氮源、水、无机盐、生长因子根据不同的微生物种类和不同的生长条件确定培养基成分，可通过查阅相关的手册获得培养基的成分 书 p46注意同一种细胞用于生产不同的酶时，培养基成分不一样细胞在生长、增殖、发酵、产酶等各阶段所需营养成分有区别尽量减少培养基中部分物质对产酶的阻遏作用第五十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制pH 值的调节和控制培养基 pH 值的显著影响 三方面！H+ 或OH 影响酶的解离和电荷分布情况，

27、引起酶构象的变化pH 值影响细胞质膜的电荷状况，改变膜的通透性pH 对底物和产物的物理化学性质也存在影响（解离平衡、溶解度、反应活性等）最适生长 pH、最适生产 pH细胞发酵产酶的最适 pH 值通常接近该酶反应的最适 pH 值，但一般不同于细胞生长的最适 pH 值培养基的 pH 值在细胞生长和发酵过程中将发生变化第五十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制温度的调节和控制生长温度与产酶温度往往不同，一般后者低于前者较低温度下，mRNA 稳定性较高，延续酶的合成温度过低，微生物代谢速度减慢，将延长发酵周期在不同的发酵阶段控制不同的温度发酵产热生

28、物热（主要） 微生物在生长繁殖过程中产生的热量，来自于代谢过程，但是同时热量扩散散失，又会使温度降低，因此培养基的温度是两者综合作用的结果其他热源（微弱） 机械热，蒸发热，辐射热温度控制 冷却水温度的双重影响第五十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制溶解氧的调节控制O2 是细胞呼吸所必需的，但细胞一般只能利用溶解氧，即溶解在培养基中的氧培养基供氧 通气搅拌，维持溶解氧含量耗氧速率KO2 耗氧速率，指单位时间内单位体积培养液中细胞的耗氧量，(mmol O2)h-1L-1QO2 细胞呼吸强度，指单位细胞量在单位时间内的耗氧量， (mmol O2

29、)h-1(g DC)-1Ccell 细胞浓度，单位体积培养液中细胞质量，(g DC)L-1第五十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制溶解氧的调节控制溶氧速率（溶氧系数 Kd）单位体积发酵液在单位时间内溶解的氧的量， (mmol O2)h-1L-1当 Kd = KO2 时，溶氧量恒定溶氧量调节方法通气量：增大通气量提高 KdO2 分压：提高 O2 分压，可增加 O2 溶解度，提高 Kd气液接触时间：延长接触时间，可增加 O2 溶解量气液接触面积：增大接触面积能提高 Kd培养液黏度：黏度大易产生泡沫，影响 O2 溶解第五十六张，PPT共九十八页

30、，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制提高酶产量的措施 (1)添加诱导物酶的作用底物e.g.乳糖 -半乳糖苷酶，以乳糖代替葡萄糖，可以使-半乳糖苷酶表达量提高数千倍酶的反应产物e.g.半乳糖醛酸（果胶酶水解产物） 果胶酶底物类似物e.g.IPTG -半乳糖苷酶，IPTG的诱导效率比底物乳糖高几百倍反应产物类似物第五十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制提高酶产量的措施 (2)控制阻遏物浓度 p51e.g.1：枯草杆菌碱性磷酸酶受其反应产物 H3PO4 的阻遏e.g.2：培养基中葡萄糖对诱导物的阻遏控制速效性碳源

31、的浓度，改用迟效性碳源，或添加cAMP，减少分解代谢物阻遏作用及时分离末端产物，控制产物浓度在低水平，减弱或解除产物阻遏作用第五十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶发酵工艺条件及其控制提高酶产量的措施 (3)添加表面活性剂增加质膜的通透性，有利于胞外酶的分泌一般采用毒性较小的非离子型表面活性剂e.g.：在木霉发酵生产纤维素酶的培养基中，添加 1% 吐温，可使产酶量最高提高 20 倍提高酶产量的措施 (4)添加产酶促进剂 作用机制不明e.g.：添加植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高 120 倍第五十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微

32、 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述发酵动力学研究发酵过程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率及环境因素（如溶解氧）对这些速率的影响规律研究意义了解酶生物合成模式发酵工艺条件优化控制提高酶产量研究方法通过发酵实验数据的分析，建立通用的 半经验 动力学模型，并用于一般的发酵过程第六十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律1950年，Monod 提出表述微生物生长的动力学方程，他认为，细胞生长速率（RX）与细胞浓度（X）成正比 细胞的比生长速率，h-1假设培养基中只有一种限制性基质 S

33、，而不存在其他生长限制因素时，比生长速率为这种限制性基质浓度（S）的函数，即(2-1)第六十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学Monod 给出的表达式为S 限制性基质的浓度m 最大比生长速率（S 过量时），当S KS 时， = mKS Monod 常数，当 = m 时，S = KS式 (2-2) 称为 Monod 生长动力学模型式 (2-2) 中不考虑细胞的死亡Monod 方程是基本的细胞生长动力学方程，根据实际需要可以从不同情况出发对其进行修正微 生 物 发 酵 产 酶(2-2)第六十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵

34、产 酶酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学Monod 方程与 Michaelis-Menten 方程比较双倒数形式：(1-7a)(2-2)(2-4)(1-7b)第六十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述一、细胞生长动力学Monod 方程的修正 在连续全混流反应器发酵过程中，稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程D 稀释速率（h-1），指单位时间内流加的培养液与发酵液体积之比D = 0：分批发酵D 0，表明细胞浓度增加D = ：dX/dt = 0，表明细胞浓度恒定（稳态）D ：dX/dt m：细胞浓度X 趋于零，无法达到新的稳态(2-3)第六十四张

35、，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学研究细胞产酶速率及各因素对其的影响宏观产酶动力学（非结构动力学）从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率微观产酶动力学（结构动力学） （补充，简单了解）从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率细胞内酶生物合成的一般模型（路径分析）分解代谢物阻遏的酶生物合成模型诱导型酶合成模型阻遏型酶合成模型第六十五张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 宏观动力学（重点）产酶速率（RE）与细胞比生长速率（）、细胞浓度（X）等因素有关，即式 (2-5) 称为宏

36、观产酶动力学方程，式中：E 酶浓度，UL-1RE 产酶速率，UL-1h-1X 细胞浓度，(g DC)L-1 生长偶联的比产酶系数，U(g DC)-1 非生长偶联的比产酶速率，U(g DC)-1h-1(2-5)第六十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 各种产酶模式下的宏观动力学方程1. 同步合成型： = 0，则2. 中期合成型：特殊的生长偶联型， = 0有阻遏存在时， =0，无酶产生阻遏解除后才开始合成酶，此时(2-6)(2-6a)(2-6b)第六十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学

37、概述二、产酶动力学 各种产酶模式下的宏观动力学方程3. 滞后合成型：非生长偶联型， = 0，则4. 延续合成型：部分生长偶联型， 0， 0参数的确定以实验为基础，对大量实验数据进行分析、综合而得出通过线性化处理及尝试误差法求出(2-7)(2-8)第六十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学（简单了解）酶生物合成的一般模型RA、RI：有活性和无活性的阻遏蛋白SI、SR：诱导物和阻遏物CC：环腺苷酸受体蛋白 CAP 与环腺苷酸 cAMP 的复合物RASI：RA 与SI 的结合物，不与操纵基因结合RISR：RI 与SR 的结合物，可与操纵基因结合，使

38、mRNA 无法合成N：RNA的分解产物微 生 物 发 酵 产 酶第六十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学酶的生物合成速率酶的生成途径酶的生成速率mRNA mRNA 的浓度，molL-1E 细胞中酶的浓度，UL-1 细胞比生长速率，h-1；对于非生长偶联型， = 0(2-101)第七十张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学(1) 分解代谢物阻遏的酶生物合成模型设细胞中 k1 和 DNA 浓度 DNA 为常数(2-102)(2-103)(2-104)

39、第七十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学对各种中间产物采用拟稳态假设，即将产酶速率用 DNA 浓度、cAMP 浓度和酶量E 来表示，即将式 (2-102)、(2-103)、(2-104) 代入式 (2-105) 并联立式 (2-101)整理得(2-105)(2-106)(2-107)第七十二张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学(2) 诱导型酶合成模型设细胞中 k2 和 DNA 浓度 DNA 为常数(2-108)(2-109)(2-110)第七十

40、三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学对各种中间产物采用拟稳态假设，即将产酶速率用 DNA 浓度、SI 浓度和酶量E 来表示，即将式 (2-108)、(2-109)、(2-110) 代入式 (2-111) 并联立式 (2-101)整理得(2-111)(2-112)(2-113)第七十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学(3) 阻遏型酶合成模型设细胞中 k3 和 DNA 浓度 DNA 为常数(2-114)(2-115)(2-116)第七十五张，PP

41、T共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述二、产酶动力学 微观动力学对各种中间产物采用拟稳态假设，即将产酶速率用 DNA 浓度、SR 浓度和酶量E 来表示，即将式 (2-114)、(2-115)、(2-116) 代入式 (2-117) 并联立式 (2-101)整理得(2-117)(2-118)(2-119)第七十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述三、基质消耗动力学研究发酵过程中基质消耗速率及影响因素基质包括碳源、氮源、氧气等发酵过程中，基质消耗通常用于细胞生长、产物生成和正常的新陈代谢，因此基质消耗速率（RS

42、）表示为这三项之和，即由于发酵过程中基质不断被利用，浓度不断降低，因此，基质消耗速率为负值第七十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述三、基质消耗动力学1. 用于细胞生长的基质消耗速率，表示单位时间内细胞生长所引起的基质浓度变化下标的 “G” 表示“生长（growth）”细胞生长得率系数（YX/S）定义为细胞浓度变化量（X）与基质浓度变化量（-S）之比(2-9)(2-10)第七十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述三、基质消耗动力学2. 用于产物生成的基质消耗速率，表示单位时间内产物生成引起的基质

43、浓度变化下标的 “P” 表示“产物（product）”产物生成得率系数（YP/S）定义为产物浓度变化量（P）与基质浓度变化量（-S）之比(2-11)(2-12)第七十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述三、基质消耗动力学3. 用于维持细胞代谢的基质消耗速率，表示单位时间内维持细胞正常新陈代谢所引起的基质浓度变化下标的 “M” 表示“代谢（metabolism）”细胞维持系数（m）定义为单位时间（t）内基质浓度的变化量（-S）与细胞浓度（X）的比值细胞维持系数主要决定于微生物种类，也受外界条件的影响(2-13)(2-14)第八十张，PPT共九十八

44、页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述三、基质消耗动力学根据物料衡算，将式 (2-9)、式 (2-11) 和式 (2-13) 相加，得到总的基质消耗速率（RS）为：(2-15)(2-15a)第八十一张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶酶发酵动力学概述酶发酵动力学小结实际发酵过程远比模型复杂，以上模型在使用时往往需要根据实际情况进行修正动力学模型参数的估算是一项重要而又复杂的问题，有时候通过实验数据拟合得到，有时候需通过大量实验数据分析并借助于经验公式估算在实验中，数据有时会呈现随机性和波动性，需要借助于数学方法和计算机编程解决第八十二

45、张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞的概念又称固定化活细胞、固定化增殖细胞固定化细胞是用各种方法固定在载体上，在一定空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞20 世纪 70 年代后期发展起来的技术目前在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功第八十三张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶的特点提高酶的产率 细胞固定化之后，单位空间内细胞密度增大，因此加速了生化反应不同发酵方式对-淀粉酶产酶率的影响细胞发酵方式稀释率(h-1)体积产酶率(UL-1

46、h-1)相对产酶率(%)固定化连续0.434875578连续0.304515535连续0.133240384分批1031122游离分批844100第八十四张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶的特点可以 反复使用，可以在高稀释率下连续发酵提高基因工程菌质粒的稳定性固定化细胞对 pH 值、温度等外界条件的适应范围增宽，对抑制剂的耐受能力增强，因此发酵 稳定性好可先经预培养再转入发酵生产，缩短发酵周期，提高设备利用率固定化发酵是 非均相体系，产品容易分离纯化一般只适用于 胞外酶 的生产第八十五张，PPT共九十八页，创作于202

47、2年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制固定化细胞预培养目的 让细胞适应固定化之后的新的环境一般采用与产酶阶段不同的培养基温度控制适应范围较宽连续发酵时，由于稀释率（D）较高，反应器内温度变化较大，因此应预先调节流加液温度培养基组分控制培养基中某些物质影响固定化载体的结构，应控制这些物质的含量第八十六张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制溶解氧的供给 限制性因素原因：传质问题解决思路加大通气量，但避免剧烈搅拌（气升式反应器）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧

48、扩散不利的载体；在制备固定化载体时，采用多孔材料或人工致孔，增强溶解氧在载体内的扩散添加能富集氧或有利于氧传递的物质降低培养基的浓度和黏度第八十七张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶固定化细胞生长和产酶动力学基本原则在固定化细胞体系中细胞分两部分：一部分是固定在载体上的细胞，浓度基本稳定；另一部分是 泄漏 到培养液中的细胞，类似于游离细胞在描述时分两部分，按固定化细胞和游离细胞分开描述固定化细胞游离细胞酶活力时间细胞浓度或酶活第八十八张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶1. 固定化细胞生长动力学体系中的细胞包括固定化的和游离的，因此下标“ g ”和“ f ”分别表示固定在载体上的细胞和游离细胞由式 (2-1) 可知根据 Monod 方程(2-16)(2-17)(2-2)第八十九张，PPT共九十八页，创作于2022年6月微 生 物 发 酵 产 酶固定化微生物细胞发酵产酶1. 固定化细胞生长动力学将式 (2-2) 代入式 (2-17)，得到固定化细胞生长动力学方程式中，mg 固定在载体上的细