凯氏定氮法精品课件

1、凯氏定氮法第1页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一测定总氮量 N%F =粗蛋白质含量%因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。第三节 蛋白质的定量测定！第2页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。改良：氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。 主要改良催化剂及消化蒸馏装置。第3页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一（一）常量凯氏定氮法原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热

2、消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。第4页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一催化剂煮沸1、消化：NCOC + 浓H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、蒸馏与吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4

3、O7 + 5H2O 3、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )凯氏定氮法原理（方程式）整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定第5页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一1. 消化加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。要防止暴沸第6页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示

4、剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。第7页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一凯氏定氮法注意事项图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a消化装置 b蒸馏吸收装置1、装置的气密性2、何时加碱3、火候控制4、难消化的 对策5、停止蒸馏第8页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一自动回流消化蒸馏仪第9页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一2. 蒸馏与吸收消化液 + 40%氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。 “以奈氏试剂”检查。同时用4%硼酸吸收Nessler试剂，K

5、2（HgI4）检验NH4+离子，析出黄色或红棕色沉淀。第10页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一3. 滴定用HCl滴定用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红） 终点：蓝色微红色计算：F要根据样品来源定 第11页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一说明及注意：本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗蛋白质）。结果准确，但费时。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。同时作一空白试验，从消化开始到滴定。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。第12页，共21页，2022年，5月20日，9

6、点19分，星期一 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。第13页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有

7、机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸现象。(NH4)2SO4 检验第14页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或黑褐色（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如颜色不变可能碱不够 。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。H3BO3吸收液的温度不应超过40，否则对NH3的吸收作用减弱而造成损失。 第15页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一（二）微量凯氏定氮法1、原理、步骤及适用范围同前2

8、、与常量法不同点：样品量、试剂用量 减少加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。3、蒸馏装置见下图 。第16页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一保持酸性第17页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一第18页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一改良式微量凯氏定氮装置 第19页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一（三）自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同前 2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。第20页，共21页，2022年，5月20日，9点19分，星期一如何测定蛋白氮？ 先把非蛋