基因诊断精品课件

1、基因诊断第1页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第一节 基因诊断学基础第二节 感染性疾病的基因诊断第三节 遗传病的基因诊断第四节 复杂性疾病的基因诊断（肿瘤）内容提要第2页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第一节 基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics第3页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二基因诊断之父简悦威 1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫血进行诊断。第4页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二一、基因诊断的概念、特点及临床意义

2、定义： 利用分子生物学技术， 检测基因及基因表达产物的存在状态， 对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子 DNA RNA 蛋白质或者多肽。 基 因疾 病第5页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二诊断依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平变化，病毒基因及其转录产物在体内从无到有感染性疾病疾病遗传性疾病复杂性疾病外伤基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活癌基因表达水平从低到高；第6页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性第7页，共161页，2022年，5月20

3、日，22点29分，星期二二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断 第8页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针 PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物 SSCP操作简便、检出率

4、不高选择合适的片段 RFLP结果可靠但限制较多选择合适的限制酶 DNA测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片第9页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二一、总论二、病毒的基因检测三、病原菌的基因检测第二节 感染性疾病的基因诊断第10页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（一）、感染性疾病分子诊断的策略1.一般性检出策略2.完全检出策略一、感染病基因诊断的总论第11页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1. 一般性检出策略和方法感染性疾病分子诊断一般性检出策略： 针对特异性

5、的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物的DNA/RNA，它能够判断有无感染和是何种病原体感染。第12页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2. 完整检出策略和方法感染性疾病分子诊断完整检出策略： 通过分子杂交结合PCR技术、特殊PCR技术和芯片技术、核酸测序技术的运用，对大多数感染性病原体作出明确判断，而且能够诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分类、分型（亚型）和耐药性鉴定。第13页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二二、感染病疾病分子诊断的常用方法1. 信号放大技术检测方法 采用多酶、多探针或二者结合等方式来增

6、加探针标记物的浓度使检测信号得到放大，从而提高检测的灵敏度。优点：稳定性、重复性及特异性都较高，结果准确，不存在可能污染的问题。缺点：灵敏度较低，不适用于微量病原微生物的分子检测。 第14页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二常见的几种方法液相杂交法杂交捕获法支链DNA技术第15页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2靶分子扩增技术检测方法（1）以PCR为基础的扩增方法 （2）替代的扩增方法 （3）探针扩增系统 优点：简便、快速、灵敏度高 缺点：易由于背景污染、扩增产物污染导致假阳性结果 第16页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星

7、期二(三)感染疾病分子诊断的标本处理 1标本的选择 主要取决于相关疾病的临床表现、感染的病理学机制。 2标本量及抗凝剂 标本量要求少，但不同方法所需标本量可能不同。肝素不适于分子检测标本的抗凝。3标本的传送、保存 比较灵活，传送过程避免污染，一般保存于-80。4标本的预处理 包括核酸的提取，另外还包括扩增抑制物的去除及潜在危险病原体的灭活。 第17页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二(四)感染病疾病分子诊断的结果解释 1阴性结果 注意检测灵敏度、核酸提取及扩增效率。2阳性结果 需考虑检测方法本身的特异性和可能受到的污染。3定性检测结果 定性分子检测结果并不能提供有关病原

8、体活力的相关信息。4疾病状况的判断 核酸存在不一定代表患病 第18页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二(五)感染疾病分子诊断的临床应用及评价 1、应用弥补血清学检测技术的缺陷 检测不能培养或生长缓慢的病原微生物 通过病原微生物的定量检测监测疾病 微生物耐药性的检测 细菌分型及流行病学调查第19页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2、评价 优点：（1）简便、快速且灵敏度和特异性都较高（2）适用于一些疾病的早期诊断、确诊性诊断及爆发性感染的大规模检测。缺点：与其它结果不相符应用原则：注意将分子检测结果结合临床特别是患者病史及、综合考虑体检、X片 CT

9、及其它各种检测结果，以便准确判断病情。第20页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二二、病毒的基因检测（一）HBV（二）HCV（三）HPV（四）HIV（五）HSV（六）CMV第21页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（一）乙型肝炎病毒Baruch Samuel Blumberg 1976年诺贝尔奖 第22页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1.病毒基因组结构 S 表面蛋白P 聚合酶C 核心蛋白X 转录蛋白第23页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2.分子诊断方法（ 1 ）信号放大技术支链DNA技术（ b

10、DNA） 2105拷贝/ml，不太适用于低浓度检测。range (2,000 to 109 copies/mL)Simens第24页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（2）液相杂交检测 125I标记核酸探针，与变性DNA杂交。闪烁计数仪定量检测标记的探针。灵敏度为106拷贝/ml。1200第25页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（3）杂交捕获系统 信号放大3000倍。灵敏度为4700拷贝/ml。dioxetaneRelease Nucleic AcidsHybridise RNA Probe captureLabel for Detection

11、Detect, readAPFDA批准第26页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（4）PCR法1）定性S、C、P和X基因中的高度保守序列2）定量实时定量PCR技术（最灵敏的方法）TaqMan探针TaqMan-MGB探针能够检测少至10拷贝/mL的HBV DNA第27页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二HBV定量HBV病毒定量第28页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 3耐药性检测（1）P基因，YMDD YVDD、YIDD）。（2）HBV-DNA前C区基因突变。荧光定量（Tm曲线）ATGGTGATTPCR-RFLPDHPLC

12、荧光定量（三探针）测序第29页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1、HBV感染的早期诊断 2、监测治疗效果 3、判断病情，指导制订合理的治疗方案 （三）临床意义第30页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二二、丙型肝炎病毒 第31页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二HCV 的RNA定性和定量分析方法： RT-PCR， TMA， bDNA， 逆向杂交多列探针检测法reverse hybridization based line probe assay，INNO-LIPA 直接测序HCV的分子检测方法第32页，共161页，2022

13、年，5月20日，22点29分，星期二表 临床应用的HCV RNA检测试剂盒检测试剂盒检测方法评价Amplicor HCV Test v2.0RT-PCR定量检测，检测下限50 IU/mlVersant HCV RNA AssayTMA定量检测，检测下限5 IU/mlIn-Laboratory Devlepoed Versant HCV RNA v3.0 AssayRT-PCRbDNA定性检测定量检测，检测限为6157.7百万IU/mlAmplicor HCV Monitor Test v2.0RT-PCR定量检测，检测限为6008十万IU/mlLaboratory Devlepoed Test

14、RT-PCR定性、定量检测Real-Time HCV Assay (ASR)RT-PCR定量检测，检测限为10-50 IU/ml10-30百万IU/ml第33页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二三、人类乳头瘤病毒 （HPV）（一）病毒基因组结构 第34页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（二）HPV的分子检测方法1、杂交捕获检测法(FDA批准) 该检测方法只能作出危险度判断，并不能确定HPV的具体型别。 对于高危险性HPV的检测会出现假阳性的结果，可能是由于高危险性HPV探针同低危险性HPV的非特异性结合，这种情况多出现在检测高浓度的HPV6或者

15、HPV42 DNA样本时。第35页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 2、核酸扩增法 FQ-PCR、 竞争性PCR 杂交PCR。 芯片第36页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二表 人乳头状病毒基因检测常用的引物 扩增位置引物序列扩增片段大小(bp)通用引物5-CGTCCAAGAGGAAACTGATC-35-GCACAGGGACATAATAATGG-3450HPV16型5-TTTTGGGTTACACATTTACAAG-35-TGTCTGCTTTTATACTAACCG-3119HPV18型5-GACACCTTAATGAAAAACGACGA-35-CG

16、TCGTTGGAGTCGTTCCTG-3103HPV6型5-TAGTGGGCCTATGGCTCGTC-35-TCCATTAGCCTCCACGGGTG-3280HPV11型5-GGAATACATGCGCCATGTGC-35-CGAGCACGACGTCCGTCCTCG-3360HPV33型5-ATGATAGATGATGTAACGCC-35-GCACACTCCATGCGTATCAG-3455第37页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二四、人类免疫缺陷病毒第38页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第39页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，

17、星期二HIV发现者2008诺贝尔奖医学或生理学第40页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第41页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二基本情况2类型（1，2）三群：主群，局外群，新群10亚型：M群中，A-J，以ENV基因分型第42页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（二）分子诊断方法蛋白水平检测 初筛：ELISA，免疫荧光试验 确证：Western Blot p24, gp120第43页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1、病毒量检测（1）RT-PCR 这是目前国内外采用较多的一种检测方法，该能对HIV

18、-1的A到H亚型病毒进行准确地定量测定。 核酸水平检测第44页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二靶序列引物和探针序列扩增片段长度（bp）LTR引物5-ACTAGGGAACCCACTGCT-35-GGTCTGAGGGATCTCTA-3探针5- ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT -3105gag引物5- ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT -35- TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC -3探针5- ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC -3115po

19、l引物5- TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCAC -35- CCTACTATACAAATCATCCATGTATTC -3探针5- ATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCT -3308表 PCR检测HIV中部分常用的引物和探针注意，ENV基因不用作靶基因*第45页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（2）其它常用检测方法 FDA认可的HIV-1病毒量检测法试剂盒名称扩增方法可报告范围Amplicor HIV Monitor v1.5 Test ROCHERT-PCR超灵敏：50100,000 c/mL标准：400750,000

20、 c/mLVersant HIV RNA 3.0 Assay (BAYER)bDNA75500,000 c/mLNuclisens HIV-1 Q7 Assay BiomerieuxNASBA176-3,470,000 c/mL第46页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（1）HIV病毒表型的检测 测序（最广泛） 高密度DNA微阵列检测法 逆向杂交多列探针检测法。 检测出“逆转录酶”和“蛋白酶”基因突变。2、病毒表型和耐药性检测第47页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 （2）HIV病毒表型的耐药性检测1）虚拟表现型技术（PhenoSense as

21、say）第48页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2）抗病毒图形检测技术（Antivirogram）第49页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二三、病原菌的基因检测（一）结核分枝杆菌（二）淋病奈瑟菌 第50页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（一）结核分枝杆菌4033基因，1734个功能已知605个见于其他菌种1694个 新基因。插入序列 第51页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1、临床标本处理标本为痰、胸腹水、血清、尿液、脑脊液等。糖蛋白，抑制核酸扩增反应，需要前处理。痰标本，液化剂除去粘蛋白，煮

22、沸法或蛋白酶/酚/氯方法提取DNA。胸腹水标本应用红细胞裂解液处理，避免Hb干扰。 （二）分子诊断方法第52页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2、分子诊断方法国内PCR法、SDA法和LCR法国外美国FDA批准的 Amplicor检测(ROCHE) MTD检测(GEN-PROBE) 靶基因16S 第53页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二靶基因MPB64IS6110IS98616S第54页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 3、耐药性检测 主要集中于对利福平抗性的检测，靶基因为rpoB基因。） PCRSSCP法 Inno-

23、Lipa Rif TB第55页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二其它耐药检测异烟肼 KatG链霉素 rpsL,rrs(16S rRNA) 喹诺酮类 gyrA、B第56页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1、基因组结构 （二）淋病奈瑟菌5000个基因无操纵子结构96%有一隐蔽性质粒部分有耐药质粒第57页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2、分子诊断方法（1）标本：宫颈拭子、尿道拭子及尿液样本。 其它标本类型，口腔、直肠、呼吸道或结膜 （2）方法： 国内： 核酸探针法、 PCR法、LCR法 国外： PCR法、SDA、TMA、杂

24、交捕获法第58页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二表14-12 FDA认可的检测淋病萘瑟菌的方法试剂盒名称检测方法靶基因说明Amplicor NGCOBAS Amplicor NGPCRNG:OMPP多重PCR检测，需要内标 BD ProbeTecTM ETC NG DNA扩增检测试剂盒SDANG: 菌毛素基因需要内标Aptima Combo 2 AssayTMANG: 16SrRNAHC2 NG IDHC2 NG Combo TestHCNG: 基因组DNA多重PCR检测需要提取核酸第59页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 3、方法评价：靶基

25、因：OMPP基因（opacity） 菌毛素（pilin）方法：LCR检测灵敏度可分别达到100和98。该检测与细菌培养法一起被作为评价其它诊断方法的“金标准”。第60页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 cppB基因（1）96存在于隐蔽性质粒上（2）染色体上整合有该基因， cppB基因检测可针对所有淋病萘瑟菌。 16S rRNA核酸杂交的检测，其敏感性可达90100。 第61页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第三节 遗传性疾病的分子诊断 第62页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 本节内容目录一、遗传性疾病分子诊断策略二

26、、镰刀型贫血的分子诊断三、产前诊断第63页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 一、 遗传性疾病分子诊断的策略（一）直接诊断策略（二）基因多态性连锁分析（三）基因突变的定量（dosage）诊断 第64页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（一）直接诊断策略定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变类型：点突变 缺失 插入 倍增前提： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制已知第65页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1、点突变的诊断 基因背景清楚的点突变等位基因特异性寡核苷

27、酸杂交 (allele specific oligonucleotide, ASO)PCR-ELISA等位基因特异性扩增 (allele specific amplification, ASA）PCR-RFLP、RFLPHRM基因芯片技术等进行诊断测序第66页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 基因背景未知的点突变单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism, SSCP)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)异源双链分析(heteroduplex

28、 analysis, HA)DNA序列测定蛋白截短测试（protein truncation test, PTT） 第67页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2、片段性突变的检测 （1）少数核苷酸缺失或插入 检测点突变的方法（2）大的片段突变 Southern印迹技术、多重PCR技术。（3）gap-PCR片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变， 碱基的缺失、插入、扩增和重组。第68页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 (二)基因多态性连锁分析检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提：致病基因尚未被定位和阐明基因太大突变种类太多检测方法：RFL

29、P，VNTR，STR，SNP第69页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二(三)基因突变的定量诊断检测方法：细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增检测内容：大范围的重复、缺失第70页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二方法分辨率说明细胞分裂中期染色体检测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5 x 106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH5 x 104用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列CGH5 x 104使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）而

30、非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH不确定将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针微卫星PCR1 x 102取决于缺失区已知的微卫星；差异PCR1 x 102要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争PCR1 x 102准确，结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；Real-time PCR1 x 102成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBR Green染料或探针，应用越来越广泛；长片段 PCR1 x 102检测基因内缺失比重复更有效，可以确定突变的性质第71页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二二、镰刀形红细胞贫血分子诊断第7

31、2页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二血红蛋白病hemoglobinopathy 结构异常血红蛋白病 镰刀状细胞贫血； 不稳定血红蛋白病 血红蛋白M病 氧亲和力改变地中海贫血， 珠蛋白的合成降低或消失第73页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。第74页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链HbA 肽 链N-val his

32、 leu thr pro val glu C(146)镰刀状细胞贫血分子机制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAGGTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG第75页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二分子诊断方法限制性内切酶法（RE）ASOARMSPCR-RFLP测序第76页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二S 肽链A肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法 (Southern Blot)MstII CC TNA GG GG ANT CC1.15 kb0.2 kb1.35 kbASSA第

33、77页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二S 肽链A肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT C268 bpASSA175 bp175268 443第78页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二产前遗传缺陷的分子诊断产前诊断（prenatal diagnosis, PND） 胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以判断胎儿是否有某种疾病的手段。植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD） IVF下，发育至68

34、 个细胞期的胚胎中，活检12 个卵裂球细胞或直接获取受精前后的极体，进行快速遗传学诊断，选择正常胚胎植入宫内，从而获得健康胎儿。 第79页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二IVF 过 程第80页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第81页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 产前遗传缺陷的分子诊断内容1、染色体异常分子诊断2、单基因病的产前（植入前）分子诊断第82页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1、染色体异常分子诊断（1）荧光原位杂交（2）比较基因组杂交 （3）间期染色体转化 第83页，共161页，

35、2022年，5月20日，22点29分，星期二2、单基因病的分子诊断PND 和PGD 诊断单基因病的分子诊断技术 （1）巢式PCR （2）全基因组扩增（WGA） （3）多重PCR （4）荧光PCR （5）突变分析法第84页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二PND与PGD的适应证可能孕严重遗传病、先天畸形胎儿的孕妇有家族史夫妇一方有染色体异常服致畸药史、病毒感染史原因不明的多次流产、死胎等胎儿发育迟缓孕妇年龄超过35岁第85页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二第四节 复杂性疾病的基因诊断第86页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期

36、二 人类除外伤以外的绝大多数疾病（包括肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病等）都是由于患者自身基因组的异常所致，其早期事件是多基因的异常和易感性改变，并经过多个阶段才出现，被称为复杂性疾病。 复杂性疾病的定义第87页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二复杂性疾病的特点1、多基因病 2、病程复杂 3、呈阶段性4、不符合孟德尔定律 5、影响大第88页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二肿瘤发展各阶段的分子改变肿瘤的发生发展是多基因异常改变的结果第89页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二DNA诊断：针对DNA的突变、缺失、插入、倒位和基

37、因融合等的分析。RNA诊断：对转录产物mRNA及表达产物蛋白质组的质和量变化的分析。分子诊断的类型第90页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二复杂性疾病分子诊断的临床意义 可对绝大多数临床复杂性疾病做出早期快速诊断 确定个体对疾病的易感性 疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等 第91页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二复杂性疾病分子诊断常用检测对象第92页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二循环核酸： 血浆DNA、RNA (plasma DNA，RNA ) ， ( circulating DNA，RNA) ，是一种无细胞状态

38、(cell free)的细胞外DNA或RNA (extra cellular DNA，RNA) 。血浆（清）DNA、RNA第93页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二血浆DNA、RNA作为检测对象的优势循环DNA（RNA）来自外周血浆或血清，较组织标本易于获得，可实现无创检查。DNA比RNA和蛋白质具有更高的稳定性，不易降解，更适合作为检测的靶分子。可以对其进行扩增，检测的敏感性高。越来越多的证据表明，疾病（特别是肿瘤）患者的循环DNA存在量和质的改变。第94页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二三、分子诊断的常用方法第95页，共161页，2022年

39、，5月20日，22点29分，星期二1.检测致病基因结构异常的方法 （1）斑点杂交（spot blot hybridization）（2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO） （3）单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP） （4）限制性内切酶图谱（restriction map）分析 （5）限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP ） （6）DNA 分子杂交（Southern blot）（

40、7）测序第96页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2基因转录水平检测（1）RNA分子杂交（Northern blot ）（2）逆转录PCR（RT-PCR） (3) 荧光定量PCR 第97页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 肿瘤的分子诊断第98页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二阶梯式遗传性疾病基因变异 表观遗传学（epigenetics）改变 DNA损伤及其分子改变 人类肿瘤的基因组不稳定性 肿瘤中染色体的异常 人类肿瘤中的微卫星不稳定性 一、肿瘤的发病机制第99页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期

41、二 早期改变包括：原癌基因点突变、插入突变和基因扩增染色体易位抑癌基因的丢失、突变和异常甲基化肿瘤早期分子异常及意义通过肿瘤分子诊断，可以发现那些病灶局限利于手术的病例，从而提高患者的生存率。第100页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二抑癌基因启动子甲基化检测技术甲基化特异性引物基因扩增（methylation specific PCR，MSP）甲基化特异性序列分析（methylation specific sequencing，MSS） 第101页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 M M -C G C G- -C G C G- 化学修饰 (s

42、odium bisulfite modification) -C G C G- -U G U G- DNA甲基化检测原理是首先对原始被分析的DNA模板进行化学修饰后，未甲基化（野生型）DNA转化为尿嘧啶，而甲基化（突变型）DNA则仍然保持不变。 化学修饰第102页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 M M -C G C G- -U G U G- MSP/MSS -C G C G- -T G T G-对未知甲基化检测样品进行化学修饰后，以针对甲基化和未甲基化（非甲基化）的特异性序列设计两对引物，对修饰后的模板DNA进行甲基化特异性引物基因扩增。MSP与MSS第103页，共

43、161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二p53基因突变和18q位点等位基因缺失与结肠直肠癌患者预后相关p53基因突变与乳腺癌患者预后相关 分子异常与肿瘤预后第104页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二未来的分子诊断实验室 通过特异性，敏感性的分子生物学技术手段，能够有效的筛查易患癌症体质的人群，对他们进行早期检测和治疗。肿瘤的分子筛查第105页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二肿瘤微小残留病的分子检测第106页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二肿瘤微小残留病肿瘤微小残留病（minimal residual d

44、isease，MRD）是指以单个肿瘤细胞，或以肉眼不可见细胞集落的形式存于肿瘤患者血液或人体组织中的肿瘤细胞。微小残留病是肿瘤复发的根本原因，其分子诊断对病人的治疗和预后具有重要意义。 第107页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二微小残留病的相关检测技术流式细胞技术(flow cytometry) 免疫细胞组织化学技术(immunocytochemistry/immunohistochemistry, ICC /IHC ) 微小残留病的核酸相关检测技术第108页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二肿瘤耐药的分子机理及其检测第109页，共161页，2

45、022年，5月20日，22点29分，星期二 1.对药物主动排出 2.肿瘤细胞对药物解毒能力的增加 3.细胞内靶酶的质、量改变 4.DNA的修复能力增强 5.细胞调亡通路受阻 6.抗肿瘤药物前体活化失败 7.癌基因活化 （一）肿瘤细胞产生耐药的机制第110页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二多药耐药基因(MDR1) /P糖蛋白多药耐药相关蛋白(MRP)肺耐药蛋白(LRP)乳腺癌耐药蛋白(BCRP) 蛋白激酶C(PKC) 金属硫蛋白(MT) BCL2 （二）常见耐药基因及其表达产物第111页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二1肿瘤耐药的检测肿瘤耐药性

46、预测 肿瘤耐药表型的检测 （三）抗肿瘤药物耐药性的检测技术第112页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二2.肿瘤耐药检测存在的问题肿瘤耐药机制复杂 检测技术手段仍有待改进 药物作用在体内和体外存在差别 临床医生的传统习惯 第113页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二114谢谢！第114页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 2. 地中海贫血 由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。类型：地中海贫血， 地中海贫血， 地中海贫血， 地中海贫血，以此类推。第115页，共161页，2022年，5月20日，2

47、2点29分，星期二地 中 海 贫 血第116页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二地中海贫血 每条16号染色体上有两个Gene缺失程度不同，链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型的地贫。 若一条染色体上缺失一个基因（）为+地贫，链合成减少。若一条染色体上两个基因均缺失（ ）为0地贫，链不能合成。第117页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二临床类型类 型症 状正常人静止型+地贫杂合子无症状轻 型（标准型）0地贫杂合子轻度贫血+地贫纯合子血红蛋白H病0地贫和+地贫双重杂合子溶血性贫血Hb Barts胎儿水肿综合征0地贫纯合子胎儿水肿第118页，共161

48、页，2022年，5月20日，22点29分，星期二胎 儿 水 肿 第119页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 地贫的分子基础 依基因缺陷程度分为：Gene缺失型（缺失1个基因）非Gene缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等结果 1 生成无功能或稳定性降低的mRNA 无义突变 移码突变 终止密码突变 起始密码突变 2 RNA加工突变 3 产生不稳定Hb第120页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 地中海贫血的分子机制 第121页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 分子诊断方法 (1) PCR法 PC

49、R 法已经成为鉴别缺失型 地中海贫血的首选方法。(2) ARMS法 该法能快速鉴别诊断HbC S和HbQ S(3) ASA法 与ARMS 法相类似(4) SSCP法 非缺失型2 地中海贫血突变 (5) 等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法第122页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二地中海贫血 珠蛋白Gene 突变或缺失珠蛋白链合成速率下 降溶血性贫血 0 地贫：链完全不能合成 + 地贫：链可部分合成第123页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二-地中海贫血临床分类临 床 类 型基 因 型基 因 产 物临 床 表 现重型地贫+/+、0/0 0/0、

50、+/0 链几乎不能合成链合成相对增加Hb F和Hb A2增高地中海贫血面容溶血性贫血（需输血）轻型地贫+/A、0/A0/A能合成适量的链贫血不明显或轻度贫血中间型地贫+/+ 链部分合成介于重型和轻型之间（不需输血）遗传性胎儿血红蛋白持续增多症缺失或突变链和链合成受抑制链合成明显增加成人Hb F持续增加，无症状第124页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血的特殊面容。第125页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，

51、在骨皮质间出现垂直短发样骨刺第126页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二-地中海贫血的分子基础 地中海贫血已发现100多种突变类型，包括点突变和 基因缺失。 绝大多数地中海贫血是由于基因发生点突变所致，突 变涉及基因内及侧翼序列。（1）编码区突变（2）非编码区突变（3）启动子区突变（4）RNA裂解信号突变（5）加帽位点单个碱基突变第127页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二编码区突变 mRNA稳定性降低或形成无功能mRNA（1）无义突变 密码子17：AC 密码子43：GT 0 地贫（2）移码突变 密码子71/72：+A 密码子41/42：TCTT

52、 0 地贫（3）起始密码突变 ATGAGG 0 地贫第128页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 内含子I GTAT丧失一个剪切信号。 新的切点产生 同义突变激活I和 Exon隐蔽裂解位点 如：GGTAGT 产生新的剪切点非编码区突变 影响mRNA剪切、加工过程第129页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二GTATGGTAGT，激活隐蔽剪切位点第130页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二启动子区突变 降低mRNA的转录效率-28位AG 突变破坏了TATA Box。第131页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，

53、星期二RNA裂解信号突变 不能准确裂解和加polyA珠蛋白基因 3侧翼序列中AATAAAAACAAA加帽位点单个碱基突变 不能准确裂解和加polyA加帽位点发生AC颠换，影响转录效率。通常是mRNA的第一个核苷酸。第132页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二分子诊断方法 PCR反向点杂交(PCR-RDB)法PCRRFLP法基因芯片法等 ND1234658710911第133页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互

54、补的原则重新配对形成双链的过程。第134页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二核酸分子杂交流程 待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针第135页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 提取DNA限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段凝胶电泳分离 变性处理DNA转印到膜上并使其牢固结合将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。1. Southern 印迹杂交(Southern blotting)第136页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，

55、转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。2. Northern印迹杂交(Northern blotting)第137页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二3. 斑点杂交（dot blotting） 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。第138页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 4. 反向斑点杂交（reverse dot blotting） 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。第139页，共161页，2022年，5月20日，22点29分，星期二 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleot