汇报B细胞迁移课件

1、汇报B细胞迁移课件汇报B细胞迁移课件B细胞分化B细胞分化pre-B cell 无膜表面Ig的表达， immature B cell 开始表达mIgM，如与抗原结合，形成自身免疫耐受。 matrue B cell从骨髓经血液迁移至外周淋巴器官，膜表面同时表达mIgM和mIgD ,mIgD的表达防止了B细胞与抗原结合后所引起的免疫耐受。 activated B cell 抗原刺激后成为activated B细胞，发生增殖和分化，膜结合Ig水平逐渐降低，而分泌型Ig逐渐增加，并可发生免疫球蛋白基因重链类别的转换。plasma cell, PC合成和分泌各类免疫球蛋白，mIg, MHC类抗原、CD19

2、、CD20、CD21等标记消失。pre-B cell 无膜表面Ig的表达， 趋化因子和受体趋化因子吸引初期的B细胞，在各B细胞亚群的归巢和在抗原非依赖性与抗原依赖性反应阶段的定位中起重要作用Distinct gene expression profiles in different B-cell compartments in human peripheral lymphoid organsYulei Shen, Javeed Iqbal, Li Xiao, Ryan C Lynch, Andreas Rosenwald,Louis M Staudt, Simon Sherman, Karen

3、 Dybkaer, Guimei Zhou,James D Eudy, Jan Delabie, Timothy W McKeithan and Wing C Chan趋化因子和受体趋化因子吸引初期的B细胞，在各B细胞亚群的归巢CCL18 由imDC分泌, 在GC 表达上调.。产生于GC DC 能吸引MNZ B细胞向GC运动 。高表达的CCL18在GC反应的启动中特别重要 。先聚集抗原到已接触抗原的pre-GC B细胞, 接着与 GC 的DC相互作用启动和维持 GC 反应。CXCL10 (IP-10) 在GC 中的表达水平升高.具有多种效果,包括刺激单核细胞和T细胞迁移 CCL20 表达增高在

4、MNZ cells. 人 nave 和 memory B细胞表达CCL20同源受体 CCR6，CCL20的高表达在MNZ nave B细胞的迁移和定位 中起至关重要的作用CXCL12 ( SDF1) 在 MGZ 细胞高表达。 CXCL12的受体是 CXCR4, 存在于 CD34+ 细胞, 骨髓细胞,CD4+ T 细胞, B细胞, 上皮细胞，内皮细胞，DC.在骨髓， 基质细胞分泌CXCL12,参与造血前体细胞在胚胎发生中迁移到骨髓。外周淋巴器官的 CXCL12可参与B细胞，可能有其它细胞如T细胞，浆细胞到 MGZ. CCL18 由imDC分泌, 在GC 表达上调.。产生于CCL14 ( HCC1

5、) 和 CCL3 (MIP-I ) 在MGZ高表达. CCL14可以通过也能识别CCL3的受体活化单核细胞 。CCL3 是清除病毒感染和先天免疫中起重要作用的促炎性细胞因子，因此，该基因在脾脏MGZ先天免疫中可能起重要作用. CXCL13 和 CCL5 MGZ and MNZ 的CXCL13 和 CCL5 在显微解剖中比在流式分选中表达上调。 以前的研究证实CXCL13(BLC) 在 Peyers patches (PP)和许多外周淋巴结的发育起重要作用，可以控制B细胞的迁移从而组成B细胞环境。CCL5 (RANTES) 基质相关的趋化因子，活化的T细胞，巨噬细胞，NK显示与CD44相互作用以

6、活化MAPK途径 。 CCL5可能在合适的条件下, 对细胞，特别是相关的MGZ B细胞识别抗原信号的活化起重要作用。 IL-7R MGZ细胞高表达IL-7R ，与其在MGZ组成中的作用相一致 。除了在B细胞分化和增殖中的作用，IL-7R 的表达也是前体细胞聚集的二级淋巴器官发育和该器官组织构成所必须的。CCL14 ( HCC1) 和 CCL3 (MIP-I )问题一B细胞是否具有迁移能力？Human Airway Epithelial Monolayers Promote Selective Transmigration of Memory T Cells: A Transepithelial

7、 Model of Lymphocyte Migration into the AirwaysLisa A. Miller and Eugene C. ButcherAMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY CELL AND MOLECULAR BIOLOGY VOL. 19 1998问题一B细胞是否具有迁移能力？研究内容淋巴细胞和单核细胞积聚在支气管壁和内腔是慢性肺病的炎性症状。单核细胞来源的巨噬细胞和淋巴细胞在肺炎性反应的维持和发展中起重要作用。淋巴细胞和单核细胞黏附到血管内皮，渗透到黏膜下细胞外基质，再穿过肺上皮进入气道。淋巴细胞和单核细胞穿过上皮进入气道有着功能性

8、意义。该细胞如何从外周血进入呼吸道？研究内容淋巴细胞和单核细胞积聚在支气管壁和内腔是慢性肺病的炎 外周血分离PBMC（梯度密度离心法）1.5-2X107/毫升悬液37C BEGM预平衡/预温transwell上室：1.5-2X106/100微升37C,5%CO2,3-4h收集下室的PBMCstandard hemocytometer计数 外周血分离结果（流式分析）结果（流式分析）问题二B细胞有迁移能力B细胞的迁移如何进行？问题二B细胞有迁移能力CD11b-mediated migratory property of peripheral blood B cells.Kawai K, Tsuno

9、 NH, Matsuhashi M, Kitayama J, Osada T, Yamada J, Tsuchiya T, Yoneyama S, Watanabe T, Takahashi K, Nagawa H.J Allergy Clin Immunol. 2005 Jul CD11b-mediated migratory prope研究背景CD11b是链整合素的成员，与2整合素形成Mac-1复合物 ，在宿主防御中免疫细胞从外周血迁移道炎症部位起中心作用。CD11b不仅使免疫细胞通过ICAM-1黏附到内皮,而且通过连接多种配体（fibronectin, collagens, lamini

10、ns ）到达内皮下和空隙细胞外基质。 最近报道中已证实CD11b表达在CD8+T细胞并在细胞迁移中起重要作用。外周血中部分B细胞表达CD11b，但其在B细胞迁移中的作用和表达CD11b的B细胞的特征尚未得到充分研究研究背景研究目的说明表达在B细胞的CD11b的功能活性 研究B细胞中CD11b表达的细胞的迁移能力。研究目的说明表达在B细胞的CD11b的功能活性外周血 B细胞分类（根据IgD CD27 ）Ig DCD27备注CB1 + -naive B cellCB2 + +memory B cellCB3 - +memory B cellCB3是classic memory B cells, 从

11、最初表达 IgM 转换到表面表达IgG， IgA或IgE。尽管 cB2带有 机体高频突变,表达IgM，说明其是memory cells的组成细胞亚群，,但其特征和基因表达与普通的 cB3有区别。活化B细胞中的一部分可分化为小淋巴细胞，停止增殖和分化，并可存活数月至数年，当再次与同一抗原接触时，很快发生活化和分化，产生抗体的潜伏期短，抗体水平高，维持时间长，这种B细胞称为记忆B细胞（memory B cell）。外周血 B细胞分类（根据IgD CD27 ）Ig DCD2研究发现，只有表达CD27的B细胞才能在有丝分裂原刺激下分泌抗体，所以CD27可以作为区分天然(naive) B细胞与抗原刺激的

12、成熟B细胞的标志。不成熟B 细胞，接触到自身抗原后便凋亡，直到它同时表达IgD 时才为成熟B 细胞(cB2)。成熟B 细胞迁移到外周免疫器官或组织，能被抗原激活而变成抗体分泌的浆细胞或对抗原再次接触产生迅速反应的记忆细胞(cB3)，未能成功完成成熟发育的B 将凋亡。分类依据研究发现，只有表达CD27的B细胞才能在有丝分裂原刺激下分泌研究方法外周血CD19+B细胞的分离流式分析细胞表面分子。细胞迁移试验。研究方法外周血CD19+B细胞的分离健康人外周血PBMCFicoll-Paque梯度密度离心法免疫磁珠分离系统CD19+B细胞FCAS：纯度97表型分析：CD19,CD27,IgD,IgM,CD

13、5,CD25,CXCR4,CXCR5（ FITC ）CD11b(PE)CD11b mAb(PE-Cy5)FCASTranswell(5m孔)实验路线健康人外周血PBMCFicoll-Paque梯度密度离心法免transwell一组二组三组四组五组六组上室0.2BSA/RPMI 2X105CD19+B细胞+Anti-CD19 mAb(20g/ml)0.2BSA/RPMI 2X105CD19+B细胞+ Anti-CD11b mAb(20g/ml0.2BSA/RPMI 2X105CD19+B细胞+ Anti-CD19 mAb(20g/ml0.2BSA/RPMI 2X105CD19+B细胞+ Anti

14、-CD11b mAb(20g/ml0.2BSA/RPMI 2X105CD19+B细胞+ Anti-CD19 mAb(20g/ml0.2BSA/RPMI 2X105CD19+B细胞+ Anti-CD11b mAb(20g/ml下室0.2BSA/RPMI0.2BSA/RPMI0.2BSA/RPMI+ SDF-1(100ng/ml)0.2BSA/RPMI+ SDF-1(100ng/ml)0.2BSA/RPMI+ BLC(500ng/ml)0.2BSA/RPMI+ BLC(500ng/ml)transwell一组二组三组四组五组六组上室0.2BSA4h下室B细胞EDTA加到下室（终浓度0.02）收集B

15、细胞FCAS迁移细胞计数CB1,CB2,CB3细胞中CD11b+细胞百分比4h下室B细胞EDTA加到下室（终浓度0.02）收集B细胞实验结果实验结果1 . CD11b+ B细胞亚群CD11b在外周血表达占B细胞的30%1 . CD11b+ B细胞亚群CD11b在外周血表达占B细2. CD11b+和CD11b-B细胞表面分子差别：CD11b-B细胞 多为IgD+CD27-IgM+CD25-, 几乎一半CD5+。可推测 CD11b- 大多数是 cB1细胞CD11b+B细胞 IgD, CD27, IgM, CD5 表达为双峰 ， CD25 表达略高，因此 cB1,cB2 ,cB3 都有CD11b+C

16、D27：细胞成熟标志。 mIgM和mIgD：不成熟B细胞表达m IgM，成熟B细胞同时表达m IgM和m IgD，抗原刺激后的B细胞m IgD很快消失 CD5：区分B1,B2细胞。CD25：IL-2受体的亚单位，表达在活化的B淋巴细胞2. CD11b+和CD11b-B细胞表面分子差别：CD11Memory B细胞 和 naive B 细胞的CD11b表达(A)大多数CD11b-B细胞是 cB1 (91.6%),而CD11b+细胞包含 cB1, cB2, and cB3 。(B)大多数 cB1 是 CD11b- (77.4%), 而大部分cB2 和 cB3 memory B细胞为 CD11b+

17、(71.5% and 81.3%） cB3 的CD11b 表达显著性高于 cB2. 即 CD11b表达水平： cB3 cB2 cB1注： cB1 (filled bar), cB2 (open bar), and cB3 (shaded bar) purified B cells (left), CD11b- B cells (middle), CD11b+ B cells（right）Memory B细胞 和 naive B 细胞的CD11b表外周血B细胞的迁移 A： 28.3%纯化的外周血 B 细胞是 CD11b+，而 迁移的细胞主要是 CD11b+（趋化因子无影响） B： CD27/Ig

18、D 双染，CD27+ memory B细胞主要是迁移的B细胞。 cB3 占 迁移细胞的40% ，而cB3 在迁移前的比例不到11.1%.迁移的B细胞主要是 CD11b+, 又以cB3 为主外周血B细胞的迁移 A： 28.3%纯化的外周血 B 细胞是SDF-1和BLC 显著增加了迁移细胞的数量，加入anti-CD11b 阻断 mAb 明显抑制B细胞的迁移SDF-1和BLC 显著增加了迁移细胞的数量，加入antiCD11b-和CD11b+B 细胞表达CXCR4 和CXCR5, 分别是 SDF-1 ，BLC的受体, 其表达水平在CD11b-和CD11b+B 细胞没有差别。 从以上数据可以推测是CD1

19、1b,而不是趋化因子受体在memory B 的迁移中起重要作用CD11b-和CD11b+B 细胞表达CXCR4 和CXCR证实了 CD11b在外周血表达占B细胞的30% 。比较了 CD11b+和 CD11b- B 细胞表面分子的表达,CD11b- 大多数是 cB1细胞. 而cB1,cB2,cB3 都有CD11b+有报道 Memory B 细胞比 naive B 细胞迁移活性高， CD11b表达水平： cB3 cB2 cB1，因此，可以推测细胞表面 CD11b表达对B细胞迁移起关键作用 小结证实了 CD11b在外周血表达占B细胞的30% 。小结研究了CD11b对B细胞迁移能力的作用。因为迁移的B

20、细胞主要是 CD11b+, 又以cB3 为主， CD11b 特异性阻断抗体明显减少了迁移细胞的数量，所以 CD11b+ B细胞比 CD11b-B细胞的迁移能力强。CD11b+ B细胞和 CD11b-B细胞趋化因子受体的表达没有差别，而迁移受抗CD11b mAb的影响，因此，迁移的差别不依赖趋化因子受体而是依赖CD11b。研究了CD11b对B细胞迁移能力的作用。因为迁移的B细胞主要讨论以前报道鼠 B-1细胞表达CD11b。最初表达于腹膜腔，产生IgM,在宿主防御中起重要作用 。然而，人的B细胞系统与鼠的有区别，尽管有CD11b表达在部分人外周血B细胞的报道，但CD11b+ B 细胞的功能活性需要

21、进一步研究。尽管B细胞的迁移受阻断性CD11b 抗体抑制，其抑制达40%。而且有小部分CD11b- B细胞也可迁移。这说明还有CD11b以外的分子参与B细胞的迁移。讨论以前报道鼠 B-1细胞表达CD11b。最初表达于腹膜腔，有报道其它黏附分子在B细胞归巢中起重要作用，整合素41，47，E7,皮肤淋巴细胞抗原表达在各B细胞亚群，这种差异被认为有助于解释B细胞移动的多样性。不同的淋巴器官表达不同的配体，如vascular cell adhesion molecule 1（VCAM1）, mucosal （黏膜）adressin cell adhesion molecule, E-selectin,

22、使B细胞选择性迁移到不同的靶器官本文证明 CD11b也对B细胞迁移起关键作用 ，不是说是影响移动的目的地，而是说影响细胞的迁移能力。有报道其它黏附分子在B细胞归巢中起重要作用，整合素41，研究的结果推测memory B 细胞，（特别是免疫球蛋白类型转换的cB3）迁移能力强，而naive B细胞迁移能力弱。memory B 细胞和naive B细胞有不同的传递（trafficking）系统： naive B细胞主要是到二级淋巴器官，如淋巴结，扁桃体，脾脏，Peyer s patches,接受阳性和阴性选择。由于naive B细胞表达低水平的CD11b, CD11b对其归巢不起主要作用。 memo

23、ry B 细胞移动到淋巴器官，也能到达淋巴结外的免疫效应部位，如肠固有层, 肺间隙, 感染的皮肤, 关节。CD11b被认为在memory B淋巴细胞外渗中起重要作用。研究的结果推测memory B 细胞，（特别是免疫球蛋白类型B细胞的移动对肌体发挥免疫效应有重要的意义。汇报B细胞迁移课件问题三乏氧对B细胞的迁移是否有影响？问题三乏氧对B细胞的迁移是否有影响？实验设计1 外周血分离PBMC。 F/H梯度密度离心法分离外周血(20ML)中的PBMC。 抗凝血，PBS （1：3）稀释，混匀后，加入到淋巴 细胞分离液（2：1）。 2000rpm,30min 吸取血浆与分离液间的PBMC层，加入到PBS

24、 中 1500rpm,20min 弃上清，PBS洗涤，800rpm,10min 弃上清，PBS洗涤，重复3遍 得到沉淀，即PBMC 细胞计数实验设计1 外周血分离PBMC。2 比较常氧，乏氧下PBMC中B细胞迁移能力的变化一组常氧二组乏氧三组常氧四组乏氧五组常氧六组乏氧上室RPMI1640+1.5-2X106/100L37C，20O2RPMI1640+1.5-2X106/100L37C，1O2RPMI1640+1.5-2X106/100L37C，20O2RPMI1640+1.5-2X106/100L37C，1O2RPMI1640+1.5-2X106/100L37C，20O2RPMI1640+1.5-2X106/100L37C，1O2下室RPMI1640600 LRPMI1640600 LRPMI1640600 LRPMI1640600 LRPMI1640600 L+ SDF-1(100ng/ml)RPMI1640600 L+ SDF-1(100ng/ml)2 比较常氧，乏氧下PBMC中B细胞迁移能力的变化一组二组三Transwell 4h