丹皮酚对MRC-5细胞的抗衰老和抑制HaCaT细胞的EMT作用

1、丹皮酚对 MRC-5细胞的抗衰老和抑制HaCaT细胞的 EMT作用一、目的 : 衰老是生物界的普遍规律, 可以是正常组织细胞的正常老化, 也与冠心病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、肝损伤等疾病有密切关系, 这些疾病所导致的机体的免疫功能降低或者脏腑功能的衰竭, 从而引起器官、组织和细胞的快速衰老 ; 其中衰老与癌症死亡率也随年龄增加而呈指数递增的关系, 尤其是60 岁以上的人群 ; 此外衰老细胞能显著分泌多种炎症因子, 趋化因子 , 生长因子等 , 这种分泌形式统称为衰老相关的分泌表型（ SASP）,SASP可以泌炎症及癌基因相关因子促进永生化的上皮细胞恶性增殖、迁移和侵袭 , 诱导上皮细胞发

2、生恶性转化和上皮间质转化（ EMT）。在 80 年代早期 ,EMT首次被人们发现并且逐渐被人们所重视 , 很多研究发现上皮间质转化与肿瘤的发生发展有着密切的关系。EMT是上皮细胞获得迁移能力的一种方式 , 近年来 ,EMT在肿瘤侵袭和转移过程中被人们所认识且越来越被关注。 通过上皮 - 间质转分化 , 细胞失去其本身的极性 , 而且也失去了与基底膜之间的连接 , 使肿瘤细胞获得了抗凋亡以及降解细胞外基质的能力 , 从而具有很高的迁移及侵袭等间质的表型。目前 ,EMT已被大多数人认为是导致恶性肿瘤发生侵袭与转移的重要因素。本实验首先利用 H2O2诱导人肺胚成纤维细胞 MRC-5发生衰老 , 而衰

3、老的 MRC-5细胞的分泌上清里包含着 SASP,其里面的炎性因子（ IL-6/IL-8）可以促进人永生化细胞HaCaTKeratinocytescells （HaCaT细胞）发生恶性转化 , 从而导致 HaCaT细胞发生 EMT。故本实验首先探讨丹皮酚对MRC-5细胞的抗衰老作用与机制, 接着利用衰老MRC-5细胞的分泌上清诱导HaCaT细胞发生 EMT,最后研究丹皮酚对HaCaT细胞EMT的作用及机制。本文实验结果证明了丹皮酚可以通过抗氧化应激和抑制EMT的作用 , 从而发挥其抗衰老和抑制恶性转化的功效。二、方法 :1 、丹皮酚对 H2O2所诱导衰老的人肺胚成纤维细胞 MRC-5的影响（

4、1）MTT法检测 0120 MH2O2对人肺胚成纤维细胞MRC-5活性的影响 , 并筛选合适的浓度用于诱导MRC-5细胞衰老。此后 , 检测 0150 M丹皮酚对H2O2所诱导衰老的人肺胚成纤维细胞MRC-5生长的影响 , 根据实验结果确定有效的丹皮酚浓度用于后续实验的研究。（2）衰老相关 - 半乳糖苷酶检测 H2O2（40,60,80 M）所诱导的人肺胚成纤维细胞MRC-5的衰老程度 , 并确定最为合适的H2O2浓度 , 以及之后丹皮酚（ 60,90,120 M）对 60 MH2O2诱导的人肺胚成纤维细胞MRC-5衰老的影响。（3）流式细胞仪检测丹皮酚对60 M H2O2所诱导衰老的人肺胚成

5、纤维细胞MRC-5的活性氧（ ROS）活性和细胞周期的影响。（4）丹皮酚和 Vit E 对 60 M H2O2所诱导衰老的人肺胚成纤维细胞MRC-5给药 24 h 后, 使用胰酶消化细胞后 , 收集消化下来的细胞 , 用 RIPA加 PMSF裂解细胞后提取处理过的总蛋白并且定量。采用 Western blot检测蛋白衰老相关蛋白p16,p53,Id-1,p21,以及抗氧化相关蛋白HO-1,Nrf2,CAT,SOD,NQO-1的表达情况。2、丹皮酚对衰老的人肺胚成纤维细胞MRC-5的分泌上清诱导的EMT的影响1）克隆形成实验检测丹皮酚对衰老的 MRC-5细胞分泌上清诱导的 HaCaT细胞恶性转化

6、程度。（2）ELISA 实验检测丹皮酚对衰老的 MRC-5细胞分泌上清诱导HaCaT细胞的细胞上清中IL-6/IL-8水平影响。（3）免疫荧光法检测丹皮酚对衰老的MRC-5细胞分泌上清诱导HaCaT细胞中 EMT上皮间质蛋白 Vimentin 的蛋白表达影响。（4）划痕方法和 Transwell 实验检测丹皮酚对衰老的 MRC-5细胞分泌上清诱导的 HaCaT细胞侵袭和迁移能力的影响。（5）Western blot 检测 EMT上皮标志物 E-cadherin,EMT 间质标志物N-cadherin,-SMA,以及转录因子和相关蛋白-catenin,Snai1,TGF-1,COX-2,MMP-

7、1,ERK1/2,p-ERK1/2,Smad2,Smad3,p-Smad2,p-Smad3的表达情况 ,重点研究丹皮酚调节ERK1/2 和 TGF-1/Smad 通路的作用。三、结果 :1 、丹皮酚对 H2O2诱导的衰老的成纤维细胞 MRC-5的抗衰老作用（ 1）MTT结果显示 :40,60,80 M的 H2O2对人肺胚成纤维细胞 MRC-5活性有明显抑制的作用并且不会杀伤细胞 ; 与 60 M H2O2组相比 , 随着丹皮酚药物浓度（ 60,90,120 M）的增加 ,H2O2诱导的 MRC-5细胞活性有明显的增加作用 ,并具有浓度依赖性。（2）衰老相关 - 半乳糖苷酶实验结果显示, 与正常

8、组相比 ,60 MH2O2浓度 ,MRC-5细胞染上蓝色的数目最多, 且细胞活性较好 , 即 - 半乳糖苷酶的阳性率高 , 细胞衰老的程度高 ; 与 60MH2O2组相比 , 随着丹皮酚药物浓度（ 60,90,120 M）的增加 ,H2O2诱导的 MRC-5细胞的衰老程度明显降低, 并具有浓度依赖性。（3）流式细胞仪检测MRC-5细胞周期的结果显示 : 与正常组相比 ,60 M H2O2使 MRC-5细胞周期生长期 S 期显著减少 ,MRC-5细胞呈衰老状态。与 H2O2组相比 , 随着丹皮酚药物浓度（ 60,90,120M）的增加 , 可以增加衰老的 MRC-5细胞细胞周期的 S 期, 促进

9、细胞增殖活力 ,并具有浓度依赖性。（ 4）流式细胞仪检测活性氧ROS的结果显示 : 与正常组相比 ,60 MH2O2促使 MRC-5细胞产生较多活性氧 （ROS）,细胞氧化的程度较高。与 60M H2O2组相比 , 随着丹皮酚药物浓度60,90,120 M）的增加 , 活性氧（ ROS）呈浓度依赖性降低 , 显著减缓 MRC-5细胞的氧化程度。（5）Western blot 检测结果显示 , 与正常组相比 ,H2O2组中的衰老相关蛋白 p16,p21,p53 及氧化相关蛋白 Nrf2,HO-1,CAT,SOD,NQO-1表达水平升高 ,Id-1 表达水平降低 ,MRC-5细胞衰老和氧化的程度增

10、高。与 H2O2组相比 , 随着丹皮酚药物浓度（ 60,90,120 M）的增加 , 衰老相关蛋白 p16,p21,p53 及氧化相关蛋白Nrf2,HO-1,CAT,SOD,NQO-1表达水平明显降低 ,Id-1表达水平升高 ,MRC-5细胞的衰老和氧化程度减缓 , 并具有浓度依赖性。 2、丹皮酚对衰老 MRC-5细胞的分泌上清诱导的 HaCaT细胞上皮间质转分化（ EMT）的作用及机制探讨（ 1）克隆形成实验结果显示 , 与正常的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCa T细胞对照组相比 , 衰老的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT细胞模型组 , 细胞的克隆形成能力明显增加。与模型组

11、相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型组的克隆形成能力降低,且在 120 M时 HaCaT细胞克隆形成能力接近对照组。 （ 2）ELISA 实验结果显示 ,与正常的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT细胞对照组相比 , 衰老的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT细胞模型组的细胞的SASP（IL-6/IL-8）明显增加。与模型组相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型组的SASP（IL-6/IL-8）明显降低 , 且在 120M时 HaCaT细胞上清的 IL-6/IL-8接近对照组。（3）免疫荧光结果显示 : 与正常的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCa

12、T对照组相比 , 衰老的MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT细胞模型组 EMT上皮间质蛋白 Vimentin 的蛋白表达明显增加。与模型组相比 , 丹皮酚（120 M）孵育的模型组的Vimentin 和 Snail的蛋白表达明显降低。（4）划痕方法结果显示 : 与正常的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT对照组相比 , 衰老的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT模型组的细胞的迁移能力明显增加。与模型组相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型组的迁移能力降低, 且在120 M时 HaCaT细胞迁移能力接近对照组。 （5）Transwell实验结果显示 : 与正常的 M

13、RC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT 对照组相比 , 衰老的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的 HaCaT模型组的细胞的侵袭能力明显增加。与模型组相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型组的侵袭能力降低, 且在120 M时 HaCaT细胞侵袭能力接近对照组。 （6）Western blot实验结果显示 ,与正常的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT对照组相比 , 衰老的 MRC-5细胞的分泌上清孵育的HaCaT模型组的细胞的EMT上皮标志物 E-cadherin表达明显下调 ; 同时 EMT间质标志物 N-cadherin, -SMA表达也显著上升 , 转录因子和相关蛋白 -

14、catenin,Snai1,TGF- 1,COX-2,MMP-1,p-ERK1/2,p-Smad2,p-Smad3表达增加。与模型组相比 , 丹皮酚（ 60,90,120 M）孵育的 HaCaT模型组细胞 ,EMT上皮标志物 E-cadherin 表达明显上升 ; 同时 EMT间质标志物 N-cadherin, -SMA表达显著下降 , 转转录因子和相关蛋白 -catenin,Snai1,TGF-1,COX-2,MMP-1,p-ERK1/2,p-Smad2,p-Smad3表达降低。表明丹皮酚通过调节ERK和 TGF-1/Smad相关信号通路抑制 HaCaT细胞的 EMT。四、结论 :1 、在抗 MRC-5细胞衰老的实验中 , 丹皮酚对H2O2诱导的 MRC-5细胞衰老模型具有较强的抗衰老作用 , 结果表明丹皮酚通过调节抗氧化Nrf2 通路 , 以及抗衰老 p16/Id-1和 p53/p21通路来逆转 H2O2诱导的 MRC-5细胞氧化和衰老。 2、在抑制 HaCaT细胞 EMT实验中 , 实验结