生化 02(蛋白质)课件

1、第二章 蛋白质的结构与功能一、概述 二、蛋白质的基本组成单位氨基酸三、蛋白质的结构 四、蛋白质结构与功能的关系 五、蛋白质的重要性质、分离纯化与鉴定学习要求 重点掌握蛋白质在生命活动中的作用，蛋白质的一、二、三、四级结构概念与特征，蛋白质结构与功能的关系；熟悉蛋白质的组成单位氨基酸。思考题 1.蛋白质分为哪些类型？各行使何种功能？ 2.自然界存在的氨基酸种类、结构、性质？ 3.肽键有何特点？对蛋白质构象的形成有何影响？ 4.何谓蛋白质的一、二、三、四级结构？维系蛋白质构象的作用力有哪些？ 5.何谓蛋白质的超二级结构和结构域？ 6.试述蛋白质一级结构和高级结构与功能的关系。 7.何谓蛋白质的变性

2、作用与复性作用？一、概 述（一）蛋白质的生物学意义和元素组成（二）蛋白质的分类（一）蛋白质的生物学意义和元素组成 蛋白质（protein）是一类重要的生物大分子，源自希腊文，1838年由荷兰化学家G H Mulder首先提出，是“最原初的”、“第一重要的”意思，中文译为蛋白质。 1. 蛋白质的生物学意义 （1）蛋白质生物学功能的多样性 酶的催化功能、控制生长和分化、代谢调节功能、运动功能、运输作用、免疫保护作用、接受和传递信息、营养功能、结构支持作用。没有蛋白质就没有生命。 （2）蛋白质生物学功能的复杂性 某一功能的发挥往往受到多种因素的影响与调节。2.蛋白质的元素组成 一般含常量元素有：碳（

3、5055）、氮（15 18）、氧（2023）、氢（68）、硫（04）。 在某些蛋白质中，还含有一些微量元素如：磷、铁、铜、钼、碘、锌等。 蛋白质元素组成的一个特点：各种蛋白质的氮含量比较恒定，平均值为16左右。 用凯氏定氮法测定氮的含量，计算蛋白质的含量（由氮的含量乘以蛋白质系数 6.25）。（二）蛋白质的分类 1.按蛋白质的构象分类 2.按蛋白质的功能分类 3.按蛋白质的组成和溶解性分类催化蛋白（酶）调节蛋白结构蛋白运输蛋白贮藏蛋白运动蛋白防御蛋白电子传递蛋白2.按蛋白质的功能分类3.按蛋白质的组成和溶解性分类 （1）单纯蛋白质（simple protein） 又称简单蛋白质，完全由氨基酸构

4、成，可据溶解度进一步分类，如血清白蛋白、胶原蛋白等； （2）结合蛋白质（complex protein） 除蛋白质部分外，还有非蛋白质部分（辅基,prosthetic group 或配基,ligand），可据辅基成分分类，如血红蛋白、核蛋白等。二、蛋白质的基本组成单位氨基酸 （一）氨基酸的结构（二）氨基酸的分类（三）氨基酸的性质 氨基酸名称符号 R 基化学结构 等电点分类H3CH3C Ala( alanine )CHCH3H3CCHCH3CH2H3CCHCH3CH2H3CCH2NCH2CH2CH2SCH2H2CH2CCHNCOOHH 缬氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 蛋氨酸 脯氨酸ValPro

5、TrpMetLeuIlePhe 异亮氨酸( valine )( leucine )( phenylalanine )( tryptophan )( methionine )( proline )( isoleucine )6.025.975.986.025.485.895.756.30非极性氨基酸( 8 种)丙氨酸（1）编码氨基酸由相应mRNA中的三联体密码编码的-氨基酸称为编码氨基酸。 1.蛋白质氨基酸参与蛋白质组成的氨基酸为蛋白质氨基酸。5.97CH2H3CCHH分类等电点R基化学结构符号氨基酸名称CH2HOOHCH2HSHOCH2CH2NOCH2CH2NOCH2甘氨酸丝氨酸苏氨酸半胱氨酸

6、酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺GlySerThrCysTyrAsnGln( glycine )( serine )(threonine )( cysteine )(tyrosine )(asparagine )( glutamine )5.686.535.025.665.415.65不带电荷极性氨基酸（8种） 硒代-半胱氨酸(seleno-cysteine，1986)se-cys CH2HNCHCNHCH氨基酸名称符号R基化学结构等电点分类CH2CH2CH2CH2CH2H3N+CH2CH2NHCNH2H2N+OOC-CH2CH2OOC-CH2His组氨酸赖氨酸精氨酸天冬氨酸谷氨酸( histidine

7、 )( lysine )( arginine )( aspartic acid )( glutamic acid )LysArgAspGlu7.599.7410.762.973.22带正电荷极性氨基酸带负电荷极性氨基酸（2）非编码氨基酸 没有相应的三联体遗传密码编码的氨基酸称为非编码氨基酸。 由编码氨基酸经羟基化、甲基化、磷酸化等修饰形成的衍生物。例如：胶原蛋白和弹性蛋白中的 4-羟脯氨酸 、5-羟赖氨酸等。 对某种氨基酸来讲，当溶液在某一特定的 pH 时，氨基酸所带净电荷为零（即正电荷数与负电荷数相等），在电场中，既不向正极移动，也不向负极移动。这时，溶液的 pH 称为该氨基酸的等电点(is

8、oelectric point)，用pI表示。 某一两性解离物质所带静电荷为零时溶液的pH。 氨基酸的等电点 （1）不同氨基酸，由于 R 基团结构的不同，有不同的等电点。在一定实验条件下，等电点是氨基酸的特征常数。 （2）当氨基酸处于等电点状态时，其溶解度最小，容易发生沉淀。 利用 pI 这一特性，可以从氨基酸的混合溶液中，分离制取（分级沉淀）各种不同氨基酸。 氨基酸等电点的作用等电点的计算 1. 一氨基一羧基氨基酸 pH=1/2(pK1+pK2)=pI （Gly） 2.一氨基二羧基氨基酸 pH=1/2(pK1+pKR)=pI （Asp） 3.二氨基一羧基氨基酸 pH=1/2(pK2+pKR)

9、=pI （Lys） 任何氨基酸的等电点等于该氨基酸兼性离子酸式解离和碱性解离相应pK的算术平均值。参见李庆章主编生物化学，中国农业出版社， p18 表2-6。 （1）氨基酸的构型 除甘氨酸以外，其余 20 种氨基酸的 C都是不对称碳原子（具有手性中心的光学活性分子，都具有旋光性 rotation）。2.氨基酸的光学活性与吸收光谱（左旋 levo）（右旋 dextro）甘氨酸的结构式（R） 参与蛋白质组成的氨基酸在可见光区都没有光吸收； 在紫外光区只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力，其最大吸收波长()分别为280nm、275nm、257nm； 是利用紫外分光光度计，在280nm波长处，测

10、定蛋白质浓度的基础。 （2）氨基酸的吸收光谱（3）氨基酸的化学反应（自学内容） 茚三酮反应（-氨基酸） 甲醛反应（-羧基反应） 2，4 - 二硝基氟苯反应（-氨基反应，鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸） 荧光胺反应与丹磺酰氯反应（-氨基反应） 异硫氰酸苯酯反应（-氨基反应）三、蛋白质的结构（一）蛋白质的一级结构（二）蛋白质的高级结构 蛋白质结构层次 1.肽和肽键 （1）肽 由氨基酸构成的线形聚合物称为肽（peptide）。二个氨基酸分子缩合而成的肽，可将其称为二肽（dipeptide）。依次类推。NHCOCNHCOCOHHHR1R2H 肽键氮氧原子共振产生：部分双键性质；多肽主链酰胺平面；C处

11、于顺式或反式构型；(以上为肽单位平面原则)二面角；偶极性（N末端，C末端）。酰胺平面 6 原子是主链骨架的重复单位，称肽单位。 多肽链（polypeptide chain）：是许多肽单位（peptide unit）通过 C连接而成的线型聚合物。（2）肽键（peptide bone）氨基酸残基HOH 蛋白质多肽链中由肽键连接的氨基酸单位称为氨基酸残基（ amino acid residue）。蛋白质一级结构的表示法肽键H2NCOHCH3SCOOHNHCCOHNHCCOHNHCCOHNHCHHCH2CHCH2OHCH2CH2中文氨基酸残基命名法：酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙 氨酰甲硫氨酸三字母符号表示法

12、：TyrGlyGlyPheMet单字母符号表示法： YGGFM 谷胱甘肽（3肽，-Glu-Cys-Gly）； 脑啡肽（5肽，Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu）； 短杆菌肽S（10肽，内含D-AA）； 肽类激素（ 9肽，N端起2为Leu、7为Ile，为催产素，催产、排乳/2为Arg、7为Phe，为加压素，增血压、抗利尿）。3.天然活性肽（二）蛋白质的高级结构 蛋白质的高级结构指的是蛋白质分子中全部原子和基团相互间的立体关系，包括全部原子和基团的排列、分布及肽链的走向。又称为蛋白质的三维结构、空间结构、立体结构或构象，可分为二级、超二级、结构域、三级和四级结构。1.蛋白质的二级结构2

13、.蛋白质的超二级结构和结构域3.蛋白质的三级结构4.蛋白质的四级结构5.稳定蛋白质高级结构的作用力1.基本知识 （1）构型与构象 构型（configuration）； 构象（conformation）1969年，IUPAC。 （2）蛋白质的立体结构原理 肽单位与二面角 将多肽链的基本结构中，-C-CO-NH-C-这一主链骨架的重复单位叫肽单位（peptide unit）。 Pauling 和 Corey 在1951年根据X-射线衍射结果，提出蛋白质肽单位平面原则：（1）肽键具有部分双键性质；（2）多肽主链形成酰胺平面；（3）C处于顺式或反式构型。肽单位平面（酰胺平面）结构NHCOCNHCOCO

14、HHHR1R2H肽单位立体结构肽单位组成的多肽链二面角（dihedral angle） 肽平面1 围绕 C2N1 单键旋转，其旋转的角度用表示； 肽平面2 也可以围绕 C2C2 单键旋转，其旋转的角度用表示。N1C 2C2 多肽链主链骨架的空间结构是由每个C的成对二面角（，）所决定的。 非键合原子间的最小接触距离 在相邻的两个肽单位的空间结构中，非键合原子间的接近有无障碍，是否符合标准接触距离，即能量是否达到最低，也是肽链空间结构能否稳定存在的重要立体化学原则。 蛋白质立体结构原理：即蛋白质某一空间结构是否存在或稳定存在，应符合肽单位平面原则和肽链立体化学原则。2.二级结构 概 念 蛋白质的二

15、级结构指多肽链主链在一级结构的基础上，某些肽段借助氢键进一步盘旋或折叠，从而形成有规律的空间结构（基本结构单元）。 主要类型 -螺旋、-折叠片、-转角、无规卷曲。（1）-螺旋 即每个氨基酸残基（n）的CO 与另一个氨基酸残基（n+4）的NH 形成（链内）氢键。 Pauling 和 Corey于1951年提出蛋白质的-螺旋（-helix）结构模型。 -螺旋的结构特征（3.613螺旋） 肽链中的酰胺平面绕C相继旋转一定角度盘旋上升形成-螺旋； -螺旋的螺距（pitch）为0.544nm，螺旋每上升1圈（360）为3.6个氨基酸残基，每氨基酸残基沿螺旋轴上升0.15nm； 螺旋中所有侧链均伸向螺旋的

16、外侧； 链中全部氢键均平行于螺旋轴，链上每个氨基酸残基（n）的CO 氧与另一个氨基酸残基（n+4）的NH氢形成一链内氢键，氢键所封闭的原子个数为13个； 二个扭角的数值=-57，=-47。螺旋结构的表示法 Smr（l） S-螺旋每一圈的氨基酸残基数； m-氢键形成的环包括的主链原子数； r（l）- 右手（或左手）螺旋。 举例说明： 3.613r -右手螺旋 3.613l -左手螺旋 310 -螺旋 4.316 -螺旋 4.314 -螺旋 电子显微镜下的人体头发（2）-折叠 伸展的多肽链靠氢键连接而成的一种片状结构称为-折叠，又称为-折叠片（-pleated sheet）。 -折叠的结构特点 构

17、象比较舒展，相邻的两条肽链有（链间）氢键维系； 折叠片互相平行，氢键与折叠片长轴垂直； R 基团交替位于折叠片的上下，与片层垂直。 -折叠的两种形式 反平行-折叠（antiparallel -pleated sheet）； 平行-折叠（parallel-pleated sheet）。（a）反平行折叠两条肽链从N端到C端方向相反。两条肽链从N端到C端方向相同。平行折叠（3）-转角 蛋白质分子中连接不同结构单位的180转弯结构称为-转角（ -turn）。由氨基酸残基（n）的CO 与另一个氨基酸残基（n+3）的NH 形成（链内）氢键。 （4）无规卷曲 多肽主链骨架没有规律性的的空间结构， 就是无规卷

18、曲（random coil）。在无规卷曲中，、角度不定。 在球状蛋白质分子中，往往含有较多的无规卷曲； 无规卷曲往往有利于多肽链形成灵活的、具有特异生物活性的空间结构。 （1）超二级结构 相邻的二级结构单元（主要是螺旋和折叠）组合在一起，形成的有规则的、空间上能够辨认的二级结构的组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构（supersecondary structure）。3.超二级结构和结构域常见的组合形式：、 （左手超螺旋）单元（发夹）曲折（Rossmann折叠）（2）结构域 多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲折叠成为相对独立、近似球形的组装体称为结构域（structure

19、domain），是三级结构的局部折叠区，平均为100AA残基。（M/H?） 结构域与蛋白质的功能密切相关，许多多结构域的酶，其活性中心都位于结构域之间。结构域之间常常只有一段肽链相连，形成所谓“铰链区”（hinge region），使结构域容易发生相对运动。结构域之间的这种柔性（flexibility），有利于酶和抗体活性的发挥。4.三级结构 多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成特定的球状分子结构，称作蛋白质三级结构（tertiary structure） 。 三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。肌红蛋白（myoglobin）5.四级

20、结构 由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成的特定三维结构（构象）称为蛋白质的四级结构（quarter-nary struc-ture）。涉及亚基的种类、数目和亚基的空间排布，包括亚基间的接触位点和相互作用关系，但不包括亚基本身的构象。 同/杂多聚蛋白质-亚基（- subunit） 血红蛋白（hemoglobin） -亚基（- subunit） 血红素 （haem）烟草花叶病毒（TMV）示意图 由2 130个相同亚基构成的螺旋对称性柱形蛋白质外壳，紧密排列于一含有6 390个核苷酸的单链RNA分子周围。解离的TMV外壳亚基和RNA，在合适的条件下能自装配成完整的TMV。6.稳定蛋白质高级

21、结构的作用力四、蛋白质结构与功能的关系 （一）蛋白质一级结构与功能的关系（二）蛋白质高级结构与功能的关系 1. 一级结构变异与生物进化 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，称为同功能蛋白质。 它们的氨基酸序列具有明显的相似性，这种现象称为序列同源，有明显序列同源的蛋白质，也称同源蛋白质。 （一）蛋白质一级结构与功能的关系 （1）同源蛋白质完全相同的氨基酸残基，称不变残基，它们决定了蛋白质的空间结构与功能。 （2）同源蛋白质有相当大变化的氨基酸残基，称为可变残基，它们的差异体现了种属特异性。 因此，对不同生物来源的同功能蛋白质的一级结构进行比较研究：可以帮助我们了解某些氨基酸对其活性重要性

22、；还可为生物进化提供新的可靠依据氨基酸序列差异越大，种间亲缘关系越远。 同源蛋白质结构的种属差异与保守性2.一级结构变异与分子病 （1）分子病 基因突变 AA变异 蛋白结构和功能改变引起的遗传病。 （2）镰刀状红细胞贫血病 由Hb分子(1/574AA)亚基N末端序列的一级结构改变引起Hb表面电荷和等电点变化，溶解度降低并出现不正常线形缔合。NH2-NH2- 正常红细胞正常红细胞和镰刀状红细胞的扫描电镜图谱（？）正常红细胞和镰刀状红细胞2009年最佳医学摄影作品来源：中国经济网 一级结构相似，可能会有相同的功能；一级结构有差异，功能会不同。如OX与ADH：.牛催产素Cys.Tyr.Ile.Gln

23、.Asn.Cys. Pro. Leu.Gly-NH2Cys.Tyr.Phe.Gln.Asn.Cys.Pro.Arg.Gly-NH2.SS987654321SS 牛加压素3.多肽激素的一级结构与功能（ADH）（OX） 催产/排乳增血压/抗利尿 不同生物（哺乳动物、鸟类、鱼类）来源的胰岛素分子一级结构，发现组成的 51 个氨基酸残基中（A/21，B/30），只有 24 个氨基酸残基始终保持不变，为不同生物所共有，为维持高级结构和生物活性所必需。4.不同生物来源的胰岛素一级结构比较5.一级结构断裂与功能激活 有些蛋白质常以无活性或低活性前体蛋白质的形式产生和贮存。在机体需要时，切去部分肽段之后，才变

24、成有活性或高活性蛋白质。如参与蛋白质消化的各种蛋白酶、参与血液凝固的凝血酶、凝血因子等。 激活（activation）：使无活性或低活性前体蛋白质变为有活性或高活性蛋白质的过程，称为激活。（牛59-60、猪62-63、人64-65的Lys-Arg ）（31-32的Arg-Arg）（21）（30）（26）约84AA（牛81、猪84、人86）残基组成（因种属不同而异）（C肽：牛26肽，猪29 肽，人31肽）前胰岛素原在N末端有一条20AA残基左右的信号肽胰岛素的结构（二）蛋白质高级结构与功能的关系1.变构调节活性2.变性丧失活性 1. 变构调节活性 蛋白质的活性随着高级结构改变而发生变化的现象称为

25、变构作用（allosteric effect）或别构作用（ allosteric effect ）。 血红蛋白具有对氧亲和力低的 T 态和对氧亲和力高的 R 态。血 红 蛋 白 -亚基（- subunit）-亚基（- subunit） 血红素 （haem）血红蛋白的变构现象（变构时的亚基移动） 1 个二聚体不动，另1个二聚体绕假想中心轴旋转15并平移0.08 nm由 T 态变为 R 态 。 血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线不同，前者是 S 形曲线，后者是双曲线。 -亚基可与氧结合，而-亚基由于存在空间位阻，几乎不与氧结合。当-亚基与氧结合后，发生三级结构的变化，此变化使相邻的-亚基发生三级结构的变

26、化，与氧结合使血红蛋白结合氧的能力在短时间内迅速上升，从，而使曲线程 S 形。氧饱和度（%）2. 变性丧失活性 天然蛋白质在变性因素作用之下，其一级结构保持不变，但其高级结构发生了异常的变化，即由天然态（折叠态）变成了变性态（伸展态），从而引起生物功能的丧失，物理、化学性质也发生改变，这种现象被称为变性作用（denaturation）。引起变性因素： 物理因素和化学因素。1.热（60100 ）；2.pH；3.盐；4.有机溶剂；5.尿素与盐酸胍；6.去垢剂等。 （1）变性表现：物理性质的改变：溶解度下降；化学性质的改变：易被蛋白酶消化；生物功能的改变：酶丧失活性、激素蛋白丧失生理调节作用、抗体失

27、去与抗原专一性结合能力。 （2）变性机理：破坏了蛋白质分子构象中的次级键。使原来埋藏在分子内部的疏水集团大量暴露出来，使分子表面水化膜破坏，分子结合沉淀。 以天然蛋白质作对照： 测定蛋白质的物理变化，观察蛋白质的溶解度是否下降，是否凝集、沉淀等； 测定蛋白质化学性质的变化； 测定蛋白质的比活性。蛋白质变性的鉴定方法蛋白质的复性作用 蛋白质的变性有可逆变性和不可逆变性之分。可逆变性在除去变性因素之后，在适宜的条件下，变性的蛋白质可以从变性态（伸展态）恢复到天然态（折叠态），并恢复全部生物活性的现象，称之为复性作用（renaturation）。（一）蛋白质的重要性质（二）蛋白质分离纯化的原则与方法五、蛋白质的重要性质、分离纯化与鉴定1.蛋白质的两性解离与等电点2.蛋白质的变性与复性3.蛋白质的呈色反应 （一）蛋白质的重要性质 蛋白质的等电点（isoelectric point） 当溶液在某个pH时，使蛋白质分子所带正电荷数与负电荷数恰好相等，即净电荷为零，在直流电场中，