异基因造血干细胞移植患者外周血TCRVβ亚家族克隆性增殖动态转变及其与GVHD的关系

1、异基因造血干细胞移植患者外周血TCR V8亚家族克隆性增殖动态转变及其与GVHD勺关系贾新颜,王健民，李扬秋，陈少华，章卫平，陈莉【摘要】 本研究观看异基因造血干细胞移植(alloHSCT患者外周血T细胞受体(TCR V (3亚家族克隆性增殖的动态转变， 分析T 细胞的克隆性演变与 GVHD勺关系。利用RT PC昉式扩增70例次 alloHSC诟患者(其中17例次显现GVHD外周血单个核细胞中24个TCR V(3基因的互补决定区3 (CDR3, PCFT物经荧光标记和基 因扫描分析CDR眼度，确信T细胞的克隆性。结果说明：移植患者T 细胞增殖一样都经历由单克隆向多克隆演变的进程，在移植后60-

2、90天时，慢慢由单克隆转为单克隆和多克隆表达大致各占一半。120天以后，无GVH速者大多转为多克隆性表达；而 GVH愚者受免疫抑制 剂和GVHD勺阻碍，直到1年以上仍有部份呈单克隆表达趋势。 GVHD 患者发生GVH或靶器官受累最明显的时候，外周血 TCRVB亚家族的 表达要紧呈现单/双克隆的表现，而通过免疫抑制医治病情好转后，部 份患者显现由寡克隆表达转为多克隆增殖趋势。结论：移植后初期患 者尤其是归并GVHD勺患者，T细胞呈克隆性增殖和T细胞受体的偏向 性利用；随着造血和免疫的恢复，TCFV(3亚家族表达从头恢复趋向正 常的多克隆性演变。【关键词】造血干细胞移植Clonal Kinetic

3、 Proliferative Changeof TCRf Subfamilies in Peripheral Blood of Patients Transplanted with Allogeneic Hematopoietic Stem Cells and Its Relation to GVHDAbstract This study waspurposed to investigate the dynamic change of clonal proliferation of T cell receptor V subfamilies in peripheral blood of pat

4、ients received allohematopoieticstem cell transplantation (alloHSCT) and to analyze therelationship between T cell clonal proliferative changes and GVHD. The peripheral blood mononuclear cell samples from 70 cases (17 GVHLpatients)undergoing alloPBCSTpatients weredetected for CDR3 (complementarity d

5、etermining region 3 repertoire analysis of T cell receptor V3 gene) using reversetranscriptase polymerase chain reaction (RT PCR) The products were further analyzed by genescan to identify T cell clonality .The sesults showedthat the patients of HSCTjenerally passed through a transformation from mon

6、oclone to polyclone. At day 60-90 after HSCT,half of the cases were monoclonal and the remainders were polyclonal. After 120 days, most of patients without GVHD transferred into polyclones, however, patientswith GVHD remained monoclonal after one year because of immunosuppressive agents and GVHDtsel

7、f. The peripheral blood of GVHLpatients mainly expressed monoclone/biclone at the time of target organ damage conspicuously, after medication intervention, partial monoclone or bioclone expressed TCR V B subfamilies were diverted to polyclonal expression. It is concluded that the T cells present clo

8、nal proliferation and T cell receptors are prone to be used whenpatients are in earlier period of transplantation or with GVHD especially. The expressionof TCR V 3 subfamiliescan return to normalpolycloningalong with the recovery of hematopoiesis andimmunity in patients.Key words haemopoietic stem c

9、ell transplantation; GVHD;T cell receptor V 3 subfamily; T cell clonality; genescanT淋巴细胞的活化需要两个信号：第一信号通过T细胞受体(TCR 抗原多肽MHCT合物，此进程是受MHC艮制的；第二信号是由多种共刺激分子提供。TCR (3链V区基因亚家族散布和克隆性分析是了 解肿瘤性或抗原特异性 T细胞和免疫功能重建情形的重要方式。TCR在重排的进程中，不同克隆所形成的抗原受体互补决定区3（complementary determining region 3, CDR3）的长度和碱基序列的不同1,决定了 TCR勺特

10、异性。应用RT PCR基因扫描方式分析 TCR V（3 24个亚家族的CDR眼度，是目前检测T细胞克隆性的一种 比较灵敏和精准的方式2。咱们应用此法动态地观看了异基因造血 干细胞移植（allo HSCT患者外周血T细胞增殖的克隆性演变，并 分析其与GVHDt生的关系。材料和方式病例选择选取我院行异基因造血干细胞移植术的急性、慢性白血病患者 27例，其中急性白血病15例，慢性粒细胞白血病12例，男性21例, 女性6例，年龄为16-50岁，平均年龄岁。别离搜集移植前、移植后 30、60、90、120和180天的外周血或搜集物，共计106例次标本（经 （3 2 MG佥测后能够利用的标本为70例次），

11、其中急性GVHD3例次, 慢性GVHD21例次，无GVH07例次。GVHD）诊断和分级标准符合西 雅图Fred Hutchinson肿瘤中心的分级法3。70例次标本中：移植 前标本8例次，搜集的移植物12例次，发生GVHD）标本17例次（急 性GVH0例次，慢性GVHD1例次），移植后无GVHD）标本33例次, 还有5例健康献血者作为对照。17例GVH速者的一样临床情形见附单个核细胞分离搜集患者外用血，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液(Ficoll ,密度) 离心分取单个核细胞层，用PBS重悬离心洗涤2次，取TRIzoL液1 ml, 吹打至无沉淀，加入EP管，置于-80 C冻存备用。RNA提取及cD

12、N始成将已加入TRIzoL试剂冻存的细胞解冻，采纳酚 氯仿异戊醇 提取法提取 RNA4-6 ,按 TaKaRa RNA PCR Kit AMV Ver 试剂J盒说 明书进行cDNA合成反映。总反映体积为 20 “，其中含5屋RNA 模板，2 “ dNTP (包括 dATP dCTP dGT可口 dTTP), l RNA 酶 抑制剂(RNase Inhibitor ),1 l AMV 逆转录酶(AMV reverse Transcriptase) , 30 c 10 分钟，42 c 30 分钟，99 c 5 分钟，5 c 5 分钟，终止后以人的(3 2 MG做为内参照检测cDNA反转录 多聚酶链

13、反映(RT PCR依口K V(3 24个亚家族基因设计相应的24个V(3特异性上游引 物，并在CB区设1个CB下游引物，引物均由德国柏林TIB公司合成 5,6。每一标本别离以 VB 124/CB 24对引物进行24次PCR检测。PCF作按已报导方式进行7。总反映体积为20膜，含1屋cDNA其中含2l dNTP （包 括dATPdCTPdGT林口 dTTP,VB 引物和 CB 引物各 1 膜，2 MgCl2, “Taq聚合酶和PCRS冲液。共进行40个循环，94C 1分钟（第 一次3分钟），60 C 1分钟，72 C 1分钟（末次10分钟），终止后保 留于4c中。各反映均设阳性和阴性对照。PCR

14、T增产物于 减脂糖凝胶（澳化乙锭染色）中电泳分析结果（图 1）。PCR production electropherogram of T cell receptor V B subfamilies . T 细胞克隆性分析荧光标记PCFT物该反映主若是将第一次 TCR VB PCR阳性产 物标上荧光素，进行不对称PCRTtI, 10屋的反映体系含”的未 标记的 PCR物、 屋 CB fam 引物3、1 l MgCl2, “ dNTP, “ Taq聚合酶和PCRS冲液。PCR进行35循环，退火温度为66C, 余条件同上。基因扫描样品的配制及电泳处置 （CDR朱度分析）有关操作步 骤按3100遗传分

15、析仪利用指南（ABI,Perkin Elmer公司生产）进行。荧光素标记的PCRT物（2江）加入 “甲酰胺， 膜Genescan 500 Tamra分子量标准品（ABI, Perkin Elmer,其中含有不同大小的 荧光标记的DN*段）和 膜 加样缓冲液（dextran 50 mg/ml, EDTA25mmol/L, Genescan 500 Tamra Kit）,灌胶后样品于 94c变性 4 分 钟，当即放置冰上冷却2分钟。变性后的样品装载到3100遗传分析仪 进行电泳。电泳进程中CCD佥测器把荧光信号转换为电信号并传送给 3100数据搜集软件工作站进行数据处置， 并以电泳信号图的形式显示

16、 出来。电泳信号图的X轴表示时刻，Y轴表示相对荧光强度，电泳信 号图中的每一个峰代表一个 DN*段。基因扫描分析荧光产物 完成 处置的数据被自动地从数据库中提取，经373A DNA序列仪（ABI,Perkin Elmer公司）的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光 素强度。其原理是检测不同时点通过扫描探头的荧光素（标记于 PCR 产物上），若是所检测的PCRT物大小一致，那么在同一时刻通过扫描 探头，形成单峰图象，提示该PCRT物所对应的样本中CDR隹长度完 全相同，即单克隆T细胞的特点。反之，若是PCRT物大小不一致， 那么电泳迁移速度不同，通过扫描探头时刻不同形成了多峰图象，即 代表

17、多克隆情形。假设显现一主峰或双峰图象，那么别离代表寡/单克 隆或双克隆情形（图2,3）。Peak shapes in genescan. A: oligoclonal;B: 3. Four kinds of figure in genescan.结 果Genescan技术对外周血T淋巴细胞TCR CDR兴度的分析正常献血者各VB亚家族谱型大多呈现多个峰的多克隆表现，即 呈正态散布7。与正常献血者不同,17例GVH电者中多数(16/17 , 占)外周血部份 V(3亚家族T细胞呈寡克隆、双克隆及不同趋势的 克隆性增殖，表现为单一主峰(寡克隆)或双主峰(双克隆)图象 (图 4),以VB 13克隆性增

18、殖最多见。Analytic result of PCRproduction genescan from GVHD patients. Note: The results of genescan analysis for PCR products from 17 patients with GVHD16 TCRVp subfamilies (%) could be found to be oligoclone or biclone expansion,which show dominant peaks or bipeak. TCR V 3 13 is the most frequent subf

19、amily ,which is found in 11 out of 17(%) and then V 3 10and V B VB亚家族的动态转变移植前患者TCR V(3亚家族的表达 在8例移植前的标本中，共 有5例为ALL患者，其要紧特点为TCR V(3亚家族呈单克隆性增生： 尤其是V(3 1亚家族，5例中有4例呈单克隆增生(表达率为80%) , V (3 10及V(3 7中共有5例为阳性结果表达，且全数为单/双克隆性增生。移植后30天的TCR/B亚家族的表达 在10例移植后30天的标 本中，有8例为无GVH速者，其要紧特点为TCR/B亚家族单克隆性 增生，以VB 、VB 13、VB 14

20、最为显著。移植后60天的TCR/B亚家族的表达 在11例移植后60天的标 本中，有3例为GVH健者，8例为无GVH速者，两组病人的要紧特 点是阳性表达的TCRVB亚家族中单克隆和多克隆的表达各占一半 (单 /双克隆：多克隆=16 : 20)。呈现单克隆向多克隆慢慢恢复的偏向。移植后90天的TCR V(3亚家族的表达 在7例移植后90天的标 本中，有1例为GVHIB者,6例为无GVHD&者，两组病人的要紧特点 大致同60天时的情形，即阳性表达的 TCR/B亚家族中单克隆和多克 隆的表达各占一半(单/双克隆：多克隆=18 ： 16),呈现单克隆向多 克隆慢慢恢复的偏向。移植后120天至1年的TCR

21、/B亚家族的表达 在21例次移植后 120天以后的标本中，有10例次为GVHIM者,11例次为无GVHIM者。 无GVHD勺患者，现在显现以多克隆增生为主的趋势， 阳性表达的TCR V(3亚家族中多克隆较单克隆的表达增加约 2倍以上，而且之前呈单克 隆表达的亚家族如：V(3、V(3 13、V(3 14等也演变成以多克隆增生 为主。9例次GVH感者中,6例次显现以单克隆增生为主的趋势， 其中 1例患者阳性表达的TCR V(3亚家族全数为单克隆增生，那时的 GVHD 反映也是最严峻的。另外2例显现多克隆增生为主表现，1例为单克 隆和多克隆比例相当的。总的来讲，在移植120天以后的TCR V(3亚家

22、族在GVH愚者要紧呈现单克隆fi增生表现，在无 GVH愚者要紧呈 现多克隆性增生表现。移植后GVHDt者经免疫抑制剂医治前后的 TCR V(3亚家族的转 变 上述病例的研究进程中，咱们观看到 3例GVH速者医治前后随着 病情的好转，其TCR V(3亚家族克隆性增殖显现动态转变，即在发生 GVH或靶器官受累最明显的时候，外周血 TCR V(3亚家族的表达要紧 呈现单/双克隆的表现，而通过免疫抑制医治病情好转后，部份原先为 寡克隆表达的TCR V(3亚家族，从头显现多克隆增殖趋势(图5)。TCR V 3 subfamily dynamic changes before and after immu

23、nosuppressive treatment of GVHD patients. 讨 论T细胞受体是T淋巴细胞表面的抗原受体，参与抗原的特异性识 别，在机体的细胞免疫应答中起着决定性作用。TCR勺CDR隹是与抗原表面结合的要紧位点。CDR隹的长度和序列决定其结构，从而决定 TCR的特异性，它犹如T淋巴细胞的“指纹”，TCFR3链V区基因各家 族CDR张度分析能够反映T淋巴细胞的功能状态。本项研究是基于 TCRS因重排时所形成的高变区CDR3i不同克隆T细胞中长度不同的 原理，经RT PCRT增不同V(3亚家族的CDR3并进一步利用基因扫 描分析确信PCR产物的长度，从而了解 CDR3K度的均

24、一，性，判定T 细胞的克隆性7。此项技术又被称为免疫指纹技术 (immunoscope。 最近几年来随着TCR CDR籍型分析的应用，慢慢熟悉到一些自身免 疫性疾病、肿瘤、感染性疾病患者体内存在特异性的T淋巴细胞克隆 性增生。日本学者Furukawa等9在系统性红斑狼疮(SLB患者体 内检测到VB 8和VB 13 T淋巴细胞的选择性扩增；Sutmuller等10 发觉V(3 2在狼疮性肾炎的发病中起到重要作用。其他研究也证明， TCR V(3亚家族的特异性优势表达，参与自身免疫性疾病的病理进程。正常情形下，机体未受任何抗原刺激时，其TCRS因的重排是随 机的，表现为多家族和多克隆性，并具有相对

25、稳固性。正常人外周血 T淋巴细胞表达所有24个V(3亚家族，均为多克隆性11。GVH速 者外周血TCR V(3基因谱系呈优势利用并显现克隆性改变，是由于供 体T细胞识别宿主细胞抗原所致的反映性增生。本研究分析了 70例次 移植后病人的外周血样本，发觉移植后 T细胞受体的增殖具有必然的 动态转变规律：移植医治之前，ALL患者的增殖要紧呈单克隆性改变， 尤其是TCR V(3 1 ；移植后患者一样经历由单克隆向多克隆转变的进 程，在移植后60-90天时，慢慢由单克隆转为单克隆和多克隆的表达 大致各占一半，至120天以后，无GVHD勺患者大多转为多克隆表达， 而GVH速者直到1年以后仍有部份TCR3E

26、家族呈单克隆增生的趋势。 GVH愚者靶器官受累最明显的时候，外周血 TCR V(3亚家族的表达要 紧呈现单/双克隆，通过免疫抑制剂医治病情好转后，部份原先为单/寡克隆表达的TCR V(3亚家族，从头显现多克隆增殖趋势。这些动态转变的要紧缘故可能与以下几点有关： 移植前的单克隆增殖与急性淋巴细胞白血病抗原刺激下肿瘤相关的单克隆增殖，抑制其他克隆的增殖和检测有关 11,12;移植后30天的时候，造血 重建大体完成，患者外周血恢复正常，但免疫抑制剂的剂量仍较大， 在那个时期不管有否GVH成生，患者外周血TCR/B亚家族的表达均 呈现为以单克隆增殖为主的情形；移植后 60-90天的时候，随着免 疫功能

27、的慢慢恢复，TCRVB亚家族的增殖由之前的以单克隆增殖为主 转变成单克隆和多克隆的表达各占一半，呈现单克隆向多克隆慢慢恢 复的偏向。这一时期是患者移植后服用的免疫抑制剂如 CsA,骁悉慢慢 减量的时候，随着免疫抑制剂作用的减少，肿瘤抗原的清除，体内 T 细胞受体的偏向性利用和定向刺激慢慢减少，而向正常的多克隆趋势 进展；移植后120天以后，TCR V（3亚家族的表达情形在有无 GVHD 的两组患者体内表达显现了不同。 无GVHD勺患者，现在显现多克隆增 生为主的趋势，而GVH速者那么因所处的病情时期不同而有所不同， 免疫抑制医治较强的患者现在仍为单克隆增殖为主，免疫抑制医治后 病情好转而减量利

28、用的患者现在显现多克隆增殖趋势。移植后1年，是慢性GVHD）好发之时，很多患者显现皮肤、口腔或肝脏等不同的损 伤，并利用程度不一的免疫抑制剂医治，这时 T细胞受体的克隆性增 殖既受到GVH冰身的阻碍，又受到免疫抑制剂的抑制作用而呈现较多 的单克隆增殖状态。至移植后1年以上，才慢慢由恢复至单克隆和多 克隆比例相当的状态。移植1年以上的无GVH速者，其TCRVB亚家 族为多克隆性增生表现。本研究结果显示了GVH速者的TCRVB亚家族的动态转变情形，有助于咱们进一步了解移植后患者的免疫重建情 形。总之，本研究提供了 GVH速者胸腺和外周的T细胞免疫功能状态的情形，为研究GVH加疫医治研究提供了一些新

29、资料。但本研究工作尚需再进一步完善，如对PC皈映的稳固性进行更有效的操纵，各TCRV(3亚家族T细胞基因的测序分析，和增加研究病例数量等等。【参考文献】1Lu J, Basu A, Melenhorst JJ, et al. Analysis of Tcellrepertoire in hepatitisassociated aplastic anemia. Blood,2004; 103:4588-45932Lee SJ. Newapproaches for preventing and treating chronic graft versus host disease. Blood, 2

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