实验十五 血清ALT测定(赖氏法)

1、实验十五血清ALT测定(赖氏法)目的】了解血清ALT活性测定的原理及测定方法。掌握血清ALT活性测定的临床意义。【原理】丙氨酸与a-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶(ALT)的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反应到达规定时间时，加入2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。生成的丙酮酸与2，色的深浅，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。后者在碱性条件下显棕红色。根据颜NaOH2，4-二硝基苯肼丙酮酸丙酮酸-2，4-二硝基苯腙(红棕色)COOH1COOHch33CO1CH。CHNHALT31HC-NH。+ch2CA+CH22-COCOOHCH2COOHCoohCH2Cooh丙氨酸a-酮戊二酸丙

2、酮酸谷氨酸求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。反应式如下：2器材】试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。耗材：血清，座标纸等。试剂】O.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)称取磷酸氢二钠(NaHPO,AR)11.928g，磷酸二氢钾(KHPO,AR)2.176g，加少量蒸馏2424水溶解并稀释至1000ml。ALT底物液称取a-酮戊二酸29.2mg,DL丙氨酸1.79g于烧瓶中，加O.lmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后冷却，用lmol/LNaOH调节pH至7.4（约加入0.5ml）,再用0.1mol/L磷酸盐缓冲液在容量瓶内加至100ml,混匀，加氯仿数滴，置冰箱可保存数

3、周。丙酮酸标准液（2umol/ml）精确称取丙酮酸钠（AR）22.0mg于100ml容量瓶中，加0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。2，4-二硝基苯肼溶液称取2,4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L盐酸10ml溶解后，加蒸馏水至100ml,置棕色瓶内，冰箱保存。0.4mol/LNaOH溶液称取16gNaOH溶于适量蒸馏水中，然后稀释至1000ml。【操作】取2支试管按下表操作：表3-16血清ALT测定（赖氏法）操作步骤加入物（ml）测定管对照管血清0.10.1ALT底物液0.5混匀，置37C水浴，保温30分钟2，4二硝基苯肼0.50.5ALT底物液0.5混匀，置37C水浴，保

4、温20分钟0.4mol/LNaOH5.05.0混匀，静置10分钟，用505nm波长比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，用测定管吸光度值减去对照管吸光度值，查标准曲线得ALT活力单位。【标准曲线绘制】见下表：表3-17血清ALT测定（赖氏法）标准曲线绘制操作步骤加入物（ml）管号012345丙酮酸标准液（2umol/ml）00.050.100.150.200.25ALT底物液0.050.450.400.350.300.250.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.10.1混匀，置37oC水浴，保温30分钟2，4二硝基苯肼0.050.050.050.050.050.05混匀

5、，置37oC水浴，保温20分钟0.4mol/LNaOH5.05.05.05.05.05.0相当于ALT单位0285797150200混匀，静置10分钟，用505nm波长比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，将各管吸光度值减去“0”号管吸光度值，以吸光度为纵坐标，各管相应的酶活性单位为横坐标，绘制成标准曲线。【正常参考范围】525卡门氏单位赖氏法的酶活力单位是根据本法中丙酮酸量及其吸光度值与卡门氏单位的对等关系，套用卡门氏单位而来。卡门氏单位的定义是：血清lml,反应液总量3ml，反应温度25C，波长340nm，比色杯光径1cm,每分钟吸光度减少0.001为一个卡门氏单位。【临床意义】ALT主要存在各组织细胞中，以肝细胞中含量最多，正常情况下只有极少量释放入血，血清中ALT活性很低。当肝细胞病变、坏死或肝细胞膜通透性增加时，ALT可大量释放入血，使血中该酶的活性显著升高，故此酶是判断肝细胞损伤的一个常用的指标。急性肝炎、药物中毒性肝细胞坏死时，血清ALT活性明显升高；肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死时，血清ALT活性中度升高；阻塞性黄疸、胆管炎时，血清ALT活性轻度升高